Création transitoires pores de la membrane cellulaire à l'aide d'une imprimante jet d'encre standard

L'objectif général de cette procédure est de créer des pores transitoires dans les membranes cellulaires à l'aide de l'impression jet d'encre. Cela est réalisé en modifiant d'abord une imprimante jet d'encre standard. La deuxième étape consiste à vider et nettoyer une cartouche d'encre d'imprimante d'origine afin de permettre l'insertion de l'encre biologique.

Ensuite, les cellules d'intérêt sont suspendues dans une solution de monomères d'actine marqués au fluorophore et de PBS afin de préparer la solution d'« encre biologique ». La dernière étape consiste à imprimer cette encre biologique sur des lames de microscope à l'aide de l'imprimante et de la cartouche modifiées. En fin de compte, la microscopie en fluorescence peut être utilisée pour démontrer que les monomères d'actine G conjugués au fluorophore Fluor four ont été internalisés par les cellules imprimées à travers des pores transitoires dans la membrane.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes classiques de transfection et de microinjection cellulaire est que cette méthode d'impression est facile à utiliser et donne une viabilité cellulaire élevée. Bien que cette technique puisse fournir des informations sur la génétique, elle peut également être appliquée à d'autres domaines d'étude tels que la biophysique cellulaire et le génie tissulaire en biophysique cellulaire. Cette technique permet d'observer facilement le cytosquelette d'une cellule au cours de la migration cellulaire.

Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons souhaité pouvoir visualiser les changements dans l'organisation du cytosquelette dus aux forces appliquées aux cellules. Commencez par déverrouiller les clips en plastique situés à la base inférieure de l'imprimante, puis retirez lentement le boîtier supérieur en plastique. Ensuite, détachez le panneau d'affichage lumineux du bouton situé en haut de l'imprimante, en le laissant connecté à la carte mère de l'imprimante.

À l'aide de lingettes Kim et d'éthanol, nettoyez l'intérieur de l'imprimante, en particulier les zones où repose la cartouche d'encre et où s'effectue l'impression. Ensuite, repérez le câble qui fournit l'alimentation électrique aux mécanismes d'avancement du papier pour le modèle HP DeskJet 500.

Ils se trouvent juste en dessous du bac à papier à gauche à l’avant ; débranchez les câbles de la carte mère. Repérez maintenant le mécanisme de détection du papier et fixez une boucle de fil au levier en plastique gris situé au-dessus et à l’arrière du mécanisme d’alimentation en papier afin de servir de poignée manuelle, puis placez une platine ici. Le support en mousse de transport pour 15 tubes de centrifugeuse est utilisé avec plusieurs lames de microscope fixées à l’aide de ruban adhésif dans la zone d’impression située devant le mécanisme d’alimentation en papier, de manière à amener les lames d’impression souhaitées à un niveau légèrement inférieur à celui de la tête d’impression de la cartouche.

Enfin, afin de maintenir une technique aseptique, placez l'imprimante à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire. Commencez par retirer la cartouche de son emballage, en laissant en place le ruban protecteur recouvrant les contacts de l'imprimante et la tête d'impression. Stabilisez le corps de la cartouche à l'aide d'une pince, en veillant à ce que le dessus vert ne soit pas gêné par un obstacle, à l’aide d’un outil de coupe rotatif portatif.

Coupez la partie supérieure verte de la cartouche, videz l'encre restante du réservoir, puis retirez le ruban protecteur en plastique recouvrant les contacts de l'imprimante et la tête d'impression. De l'eau risque de s'écouler de la tête d'impression pendant cette opération, mais cela ne causera aucun dommage à la cartouche. Lorsque l'eau s'écoule claire, laissez la cartouche sécher.

Pour maintenir un environnement d'impression propre, commencez par plonger complètement la cartouche dans un bécher rempli d'eau déionisée, puis soumettez-la à une sonication pendant 15 minutes. Après la sonication, retirez la cartouche et secouez pour éliminer l'excès d'eau. Vaporisez de l'éthanol à 70 % à l'intérieur de la cartouche afin de créer un environnement plus aseptique.

Après avoir récolté les cellules d'intérêt, centrifuger les cellules dans cinq millilitres de milieu frais dans un tube conique de centrifugeuse de 15 millilitres pendant cinq minutes à 250 ×g à température ambiante. Ensuite, aspirer le milieu, puis resuspendre les cellules à une concentration de 1 × 10⁵ cellules par millilitre dans une solution fraîchement préparée de stock de G-actine fluorescente. Pour préparer l'encre biologique, noter que 250 microlitres d'encre biologique permettent d'imprimer trois lamelles avec le motif de lignes montré ici. Une fois l'imprimante allumée et préchauffée, placer la surface d'impression souhaitée ici ; des lamelles de 22 millimètres sur 22 millimètres sont utilisées au centre de la platine précédemment assemblée.

Ensuite, ouvrez un logiciel de dessin et sélectionnez le motif souhaité. Prélèvez maintenant à l’aide d’une pipette environ 100 à 120 microlitres de la suspension cellulaire et déposez-les dans le petit puits circulaire situé au fond du compartiment de la cartouche. Imprimez le fichier pendant que l'imprimante se réchauffe à nouveau ; la cartouche se déplacera alors en position prête.

Lorsque la cartouche se déplace légèrement à gauche du puits de goutte d'encre et reste en position, soulevez le mécanisme d'alimentation du papier : le fil et l'impression démarreront. L'imprimante imprimera sur la lamelle placée au centre du plateau d'impression à l'aide d'une imprimante jet d'encre HP 500 et d'une encre biologique composée d'une suspension de fibroblastes dans une solution de monomères de G-actine.

Des cellules d'encre de cartouche HP 26 series ont été imprimées sur des lamelles de microscope en verre. Cette figure illustre un résultat représentatif de cellules de fibroblastes imprimées montrant des monomères d'actine fluorescents incorporés. Ce motif a été utilisé dans la figure précédente pour créer une ligne continue de la solution d'impression sur la majeure partie de la lame de microscope.

Dans cette figure, la ligne droite sur laquelle le biolink et les cellules ont été déposés de manière conjointe est représentée. Notez qu'immédiatement après l'impression, il y a une augmentation de la fluorescence de fond, car la solution de biolink dans laquelle les cellules sont en suspension contient des monomères d'actine marqués par fluorescence en excès. Une incubation des cellules d'environ 10 minutes après l'impression favorise l'adhésion à la lame, permettant de laver la solution excédentaire de monomères avec un milieu de croissance frais, réduisant ainsi significativement la fluorescence de fond. Ici, une image représentative de trois fibroblastes T3 imprimés dans une zone d'impression localisée est présentée ; cette microphotographie en microscopie fluorescente d'une cellule prise 15 minutes après l'impression montre l'actine en vert, le noyau en bleu, et la superposition de la coloration de l'actine GI et du colorant nucléaire.

Les deux images suivantes montrent la microscopie de fluorescence de deux fibroblastes disposés en motif linéaire trois heures après l’impression. Cette première image montre les monomères d’actine marqués par fluorescence à l’intérieur des cellules. Cette seconde image est une superposition du canal de fluorescence avec l’image de fond, montrant que, bien qu’il puisse y avoir des débris sur la lame dans le coin inférieur gauche, ceux-ci ne présentent pas de fluorescence.

Enfin, un groupe témoin composé de cellules non imprimées incubées pendant trois heures avec des monomères marqués par fluorescence est présenté ici afin de démontrer que les monomères ne peuvent pas pénétrer la membrane cellulaire sans perméabilisation membranaire induite par l’impression cellulaire. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de disposer de plusieurs cartouches nettoyées et prêtes à l’emploi, car l’obstruction de l’imprimante constitue l’un des problèmes qui ralentit cette technique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment convertir une imprimante de bureau classique afin d’imprimer des cellules vivantes, ce qui permet de créer une force membranaire transitoire.