Séparation de l'ADN simple brin, double brin de l'ADN et l'ARN à partir d'un environnement communautaire viral en utilisant chromatographie d'hydroxyapatite

Cette vidéo démontre une procédure permettant de séparer des assemblages viraux mixtes selon leur composition en acides nucléiques. Cela permet d'étudier la diversité taxonomique et le potentiel fonctionnel d'assemblages viraux complexes. Ici, l'hydroxyapatite, une forme cristalline de phosphate de calcium, est utilisée pour la séparation des acides nucléiques.

Tout d'abord, une colonne d'hydroxyapatite est chargée et équilibrée, puis les acides nucléiques viraux purifiés sont appliqués sur la colonne. L'interaction électrostatique entre les ions calcium positifs de l'hydroxyapatite et la chaîne phosphate négative des sous-types d'acides nucléiques fixe les acides nucléiques sur la colonne Nick. Ensuite, l'ADN simple brin, l'ADN-ARN et l'ADN double brin sont élués séquentiellement à l'aide de concentrations différentes de tampon phosphate. Les acides nucléiques obtenus sont ensuite désalinisés et concentrés en vue de leur visualisation, de leur quantification et de leur identification par séquençage de l'ADN. Une électrophorèse sur gel agarose confirme que les espèces d'acides nucléiques peuvent être séparées avec moins de 9 % de rémanence.

Ainsi, cette méthode permet d'évaluer la diversité et la capacité fonctionnelle des communautés virales. Bonjour, je m'appelle Doug Fro et je suis chercheur associé dans le laboratoire de la Dre Shannon Williamson à l'institut j Craig Venture. Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure permettant de séparer l'ADN simple brin, l'ADN double brin et l'ARN à partir d'un assemblage viral environnemental.

Cette méthode présente des avantages par rapport aux méthodes existantes, telles que le traitement avec le noyau, qui cible soit l'ADN soit l'ARN. La chromatographie sur hydroxyapatite permet de capturer l'ensemble de la communauté virale. Cette méthode nous permet de répondre à plusieurs questions dans le domaine de l'écologie virale.

Par exemple, quel est le complément génétique total ou la diversité de la communauté virale ? Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous souhaitions étudier l'ensemble des assemblages planctoniques du Rio dans la baie de Chesapeake sans sacrifier un sous-ensemble de la signature génétique. Les solutions nécessaires à cette expérience doivent être préparées à l'avance conformément aux instructions du protocole écrit joint, et comprennent un tampon phosphate 0,12 molaire, un tampon phosphate 0,20 molaire, un tampon phosphate 0,40 molaire et une solution phosphate un molaire.

Tous à pH 6,8 et hydroxyapatite hydratée le jour de l'expérience, équilibrer tous les tampons phosphates et l'hydroxyapatite hydratée en les plaçant dans un bain-marie à 60 degrés Celsius. Commencer cette procédure en préparant la colonne econo qui sera utilisée pour la séparation des acides nucléiques viraux. Fixer un robinet à l'extrémité de la colonne econo et s'assurer qu'il est fermé.

À l’aide d’une pipette, ajoutez de l’eau déionisée sur la colonne, puis placez le bouchon sur le haut de la colonne et inversez-la plusieurs fois pour la rincer. Versez l’eau et répétez ce rinçage plusieurs fois. Ensuite, retirez le robinet de la colonne Econ et stérilisez-le au autoclave.

Le robinet n'est pas autoclavable car il fondrait. Rincer le robinet avec de l'eau ionisée, puis à nouveau avec de l'éthanol à 70 %, et le laisser sécher à l'air après l'autoclavage. Remplacer le robinet et le fermer.

Ensuite, en travaillant sous hotte, ajoutez un millilitre de sigma coat sur la colonne et recouvrez la paroi en verre de la colonne en inversant celle-ci avec un mouvement de roulis, comme illustré ici. Le recouvrement avec un sigma coat réduira au minimum l'adhérence des acides nucléiques à la surface en verre. Pendant la séparation, les surfaces en verre salin ont été recouvertes.

Ouvrez le robinet et versez dans un tube conique. Ensuite, pour relier la colonne à un bain d'eau thermostaté, utilisez deux pinces pour fixer la colonne sur un support universel. Reliez un tuyau en silicone provenant du bain d'eau thermostaté, de sorte que le flux d'eau circule du bas vers le haut.

Régler la température à 60 degrés Celsius et démarrer la circulation. En pratique, la colonne et les tubulures seraient enveloppées dans un isolant, comme de la feuille d'aluminium ou une isolation thermique pour tuyauterie. Afin de minimiser les pertes de chaleur, cette étape n'est pas illustrée ici.

Afin de mieux visualiser la procédure, fermez le robinet. À l’aide d’une pipette, ajoutez 10 millilitres d’eau stérile exempte d’ARN. Ouvrez le robinet et laissez s’écouler l’eau.

Ensuite, effectuez un nouveau lavage en suivant la deuxième étape de lavage. Rincez deux fois avec 10 millilitres de tampon phosphate stérile exempt d'ARN à 0,12 molaire et décantez entre chaque lavage. La colonne est désormais prête pour la chromatographie sur hydroxyapatite.

Veillez à ce que le robinet de la colonne econ soit fermé. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique stérile de deux millilitres, ajoutez lentement deux millilitres de l’hydroxyapatite réhydratée et remise en suspension préparée au fond de la colonne. Remettez le bouchon de la colonne.

Laisser le précipité d'hydroxyapatite se déposer sous l'effet de la gravité pendant 30 minutes. Cette méthode exige une attention méticuleuse. La colonne d'hydroxyapatite se traite à un débit de 0,25 à 0,5 mils par minute.

Il est donc très important de surveiller attentivement la colonne pour qu'elle ne s'assèche pas. Après 30 minutes, ouvrez le robinet pour laisser s'écouler le tampon dans un récipient de déchets. Fermez le robinet et jetez l'écoulat.

Combiner les acides nucléiques avec un tampon phosphate 0,12 molaire dans un volume final de 500 microlitres et incuber à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Cette étape permet d'équilibrer les acides nucléiques à la température de la colonne et d'améliorer la séparation des différentes espèces d'acides nucléiques en éliminant toute structure secondaire éventuellement présente. À l’aide d’une pipette serologique de deux millilitres, appliquer rapidement la solution d’acides nucléiques sur l’hydroxyapatite, en prenant soin de ne pas perturber la colonne.

Une fois que les 500 microlitres entiers se sont écoulés sur la colonne, une petite quantité de tampon phosphate 0,12 molaire peut être ajoutée au sommet de la colonne afin d'éviter qu'elle ne s'assèche. Laisser les acides nucléiques se lier à l'hydroxyapatite pendant 30 minutes. Après l'incubation de liaison, placer un tube conique de 15 millilitres sous la colonne.

Ensuite, ouvrez le robinet et recueillez l'échantillon initial de 500 microlitres, qui contient de l'ADN simple brin. Une fois que 500 microlitres ont été recueillis, fermez le robinet. Ajoutez ensuite six millilitres de tampon phosphate 0,12 molaire à l'hydroxyapatite, en veillant à ne pas perturber la colonne.

Ensuite, ouvrez le robinet et continuez à recueillir l'écoulement contenant l'ADN simple brin dans le même tube de 15 millilitres utilisé à l'étape précédente. Une fois environ six millilitres recueillis, fermez le robinet. Ajoutez un volume égal de solution de phénol-chloroforme-alcool isoamylique au tube, mélangez vigoureusement par vortexage, puis centrifugez à 3 500 ×g pendant 15 minutes.

Après la centrifugation, le tube contiendra deux couches. Transférez la couche supérieure aqueuse, qui contient le brin simple d'ADN, dans un nouveau tube de 15 millilitres, et conservez l'échantillon à température ambiante pour éluer et purifier l'ARN à partir de la colonne, ajoutez six millilitres de tampon phosphate 0,20 molaire et récupérez les éluats en utilisant un nouveau tube de 15 millilitres. Ensuite, effectuez une extraction au phénol-chloroforme.

Pour l'échantillon d'ADN simple brin, répétez ce processus en utilisant six millilitres de tampon phosphate 0,40 molaire afin d'éluer et de purifier l'ADN double brin de la colonne. Enfin, pour éliminer tout ADN double brin résiduel de la colonne, répétez ce processus une fois supplémentaire.

Cette fois, utilisez six millilitres de tampon phosphate 1,00 molaire pour désaler les échantillons d'acides nucléiques. Transférez quatre à cinq millilitres de chaque échantillon vers un dispositif de filtration centrifuge Ultra-4 équipé d'une membrane ultra-cellulaire avec un seuil de coupure en poids moléculaire de 30 000, puis concentrez l'échantillon à moins de 500 microlitres en centrifugeant à 6 000 ×g à 30 degrés Celsius pendant environ cinq minutes dans un rotor à angle fixe. Après avoir éliminé le flux traversant, ajoutez le reste des échantillons au filtre.

Compléter le volume à quatre à cinq millilitres avec du tampon 1 XTE sans ARN. Ensuite, effectuer une nouvelle centrifugation jusqu'à obtention d'un volume concentré. Environ cinq minutes après la centrifugation, ajouter quatre à cinq millilitres de tampon 1 XTE sans ARN au filtre et concentrer.

Répétez à nouveau ce lavage cinq fois supplémentaires pour désaler complètement les échantillons d'acides nucléiques. Une fois les échantillons complètement concentrés et désalés, transférez les échantillons d'acides nucléiques restants dans un tube stérile de 1,7 millilitre pour microcentrifugeuse. Précipitez les acides nucléiques en ajoutant un dixième du volume d'acétate de sodium, deux volumes d'éthanol à 100 % et un microlitre de glyco bleu, puis mélangez soigneusement par vortexage et centrifugation.

Un 28 000 GS à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes à Kent. Veiller à ne pas perturber le culot.

Ajouter 300 microlitres d'éthanol à 70 %, centrifuger à 28 000 ×g à température ambiante pendant 10 minutes, puis ne pas laisser sécher et redisperser chaque fraction dans un volume approprié de tampon TE sans ARN. Des concentrations équivalentes d'acides nucléiques viraux M13 MP18, ADN simple brin MS2, ARN simple brin, ARN double brin FI6 et ADN double brin lambda ont été mélangées, puis séparées par chromatographie sur hydroxyapatite, comme illustré dans cette vidéo. Des concentrations équivalentes de M13 MP18, ADN simple brin MS2, ARN simple brin, ARN double brin FI6 et ADN double brin lambda ont été combinées, comme indiqué dans la piste 6, puis appliquées sur une colonne d'hydroxyapatite, comme on peut le voir ici.

Les acides nucléiques simples brins ADN-ARN et l'ADN double brin ont été élués indépendamment de la colonne d'hydroxyapatite à l'aide de tampons phosphates à 0,12 molaire, 0,18 molaire, 0,40 molaire et 1,00 molaire. Une échelle de 1 kb a été utilisée pour confirmer les tailles du génome. Ces résultats indiquent que cette méthode peut être utilisée pour séparer efficacement l'ADN simple brin, l'ADN double brin et l'ARN, avec moins de 9 % de contamination résiduelle d'une fraction à l'autre.

Cette méthode a également été utilisée pour séparer les acides nucléiques isolés d'une communauté virale présente dans la baie de Chesapeake, comme illustré ici. L'ADN-ARN simple brin et l'ADN double brin ont été élus indépendamment à l'aide de concentrations en tampon phosphate de 0,12 molaire, 0,20 molaire et 0,40 molaire, ou 1,00 molaire respectivement. Une échelle d'ADN de haute masse dans la voie un et une échelle de 1 KB dans la voie deux ont été utilisées pour confirmer visuellement la masse moléculaire approximative et la taille des acides nucléiques. Comme on peut le voir ici, l'ADN double brin était le type d'acide nucléique dominant extrait du plancton viral de la baie de Chesapeake. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la séparation des acides nucléiques provenant d'un assemblage viral mixte à l'aide de la chromatographie sur hydroxyapatite.

Cela inclut la préparation de la colonne d'hydroxyapatite et des acides nucléiques, la séparation et l'élution des acides nucléiques à l'aide de différentes concentrations de tampon phosphate et la désalinisation, ainsi que la concentration des acides nucléiques après la séparation.