Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

L'objectif général de l'expérience suivante est de développer un substrat structuré en deux dimensions permettant de contrôler l'absorption des protéines et la croissance cellulaire. Cette réalisation s'appuie sur la photolithographie pour fabriquer un modèle structuré, utilisé ensuite pour produire un tampon en A-P-D-M-S destiné à l'impression par microcontact. Dans une deuxième étape, on prépare un substrat en or structuré, qui implique une impression par microcontact afin de créer un motif présentant des zones capables d'absorber ou de résister à l'adsorption des protéines.

Ensuite, des protéines et des cellules sont ajoutées au substrat afin de visualiser le motif et de mener l'étude. Les résultats concernant la croissance et le comportement cellulaires obtenus montrent une bonne confinement des protéines et des cellules sur ces substrats structurés, comme en témoignent la microscopie de fluorescence et le contraste d'ombre. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes, telles que l'impression MicroCon de protéines, réside dans le fait que la monocouche terminée par un groupe glycol résiste à l'adsorption non spécifique des protéines et des cellules en arrière-plan du motif.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la technique de stampage adéquate doit être optimisée pour chaque motif imprimé. Pour commencer la préparation du moule matrice, placez la plaquette de silicium sur le spin-coater, puis rincez la plaquette avec de l'acétone durant la première étape du programme de rotation en deux cycles. Durant la deuxième étape du programme de rotation, l'acétone s'évaporera, laissant la plaquette propre et sèche au début de la rotation ; appliquez alors du photo-résist sur la plaquette, puis effectuez un revêtement par rotation en utilisant les conditions décrites précédemment.

Faire durcir doucement la plaquette recouverte de résine photosensible à 110 degrés Celsius pendant deux minutes à l’aide d’une plaque chauffante à haute uniformité. Ensuite, réaliser le motif photolithographique. Exposer la plaquette recouverte de résine photosensible à l’aide d’un système d’alignement par masque et d’un masque approprié.

Placez d'abord le substrat sur le plateau sous vide du traceur de masque. Insérez ensuite le masque dans le plateau du support et activez le vide pour maintenir le masque en place, en confirmant ainsi un bon contact entre le masque et le substrat. Remontez le substrat jusqu'à ce qu'il entre en contact avec le masque.

Utilisez l'optique de l'aligneur pour confirmer qu'un bon contact a été établi. Enfin, allumez la lampe afin d'exposer le substrat à la lumière UV à travers le masque lithographique. Réalisez le développement de la plaquette structurée dans le révélateur pendant un minute quarante-cinq secondes avec une agitation douce.

Rincez soigneusement à l’eau déionisée de qualité semi-conducteur et séchez à l’aide d’un courant d’azote gazeux. Vérifiez le développement du motif à l’aide d’un microscope équipé d’un filtre UV. Commencez cette procédure en préparant un mélange de résine durcisseur dans un rapport de 10 à 1 en poids. Mélangez complètement le CIGAR 180 2.

Couvrez la plaquette photostructurée avec le mélange dans une boîte de Pétri jetable placée dans un dessiccateur sous vide afin de dégazer, jusqu'à ce qu'aucune bulle ne soit visible sur le moule recouvert de PDMS. Une fois que vous vous êtes assuré que le moule se trouve bien au fond de la boîte, laissez le tampon polymériser dans un four à 65 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Lorsque le tampon en PDMS est complètement polymérisé, découpez-le du moule puis taillez-le à la taille appropriée.

Conserver le tampon dans un récipient couvert, côté motif vers le haut, afin de le protéger de la poussière et des débris. Pour préparer les substrats en vue du dépôt de métal, traiter d'abord des lamelles rondes en verre au plasma d'oxygène pendant 10 minutes. Rincer ensuite les lamelles deux fois avec de l'eau déionisée, en séchant avec un flux de gaz azote entre les rinçages ; après le rinçage à l'eau, rincer deux fois avec de l'éthanol, en séchant à nouveau avec un flux de gaz azote entre chaque rinçage.

À l’aide d’un système de dépôt par faisceau d’électrons à compartiments multiples, déposer 50 angströms de titane suivis de 150 angströms d’or. Ne pas ventiler l’évaporateur entre le dépôt de la couche de titane et celle de l’or. Rincer le tampon en PDMS avec de l’éthanol et sécher soigneusement.

Avec du gaz azote, appliquer la solution de transfert sur le tampon goutte à goutte jusqu'à ce qu'il soit entièrement recouvert. Sécher complètement le tampon avec du gaz azote. Le microcontact printing du fichier HEXA Décane dépend des caractéristiques du tampon en PDMS et constitue l'un des aspects les plus difficiles de cette procédure.

Un estampage réussi nécessite le développement d'une bonne technique appliquant une pression uniforme. Pendant l'estampage. Pour une impression microcontact classique dans l'air, appuyez doucement l'estampage sur le substrat en or et laissez la monocouche se former pendant 15 secondes.

Alternativement, pour des motifs composés de caractéristiques très petites et de rapports d'aspect élevés, placez le substrat en or dans une boîte de Pétri contenant de l'eau déionisée de 18,2 mégohms, en veillant à ce que le substrat soit immergé. Ensuite, appuyez délicatement le tampon sur le substrat en or et laissez la monocouche se former pendant 15 secondes. Puis rincez le substrat tamponné deux fois à l'éthanol et séchez à l'aide de gaz azote.

Après chaque rinçage, placer le substrat dans une boîte de Pétri et recouvrir le substrat d'une solution de comblement. Sceller la boîte avec du parafilm pour éviter l'évaporation. Laisser former la monocouche de fond pendant 12 à 14 heures dans l'obscurité.

Enfin, retirez la lamelle imprimée de la solution de remplissage arrière et rincez deux fois avec de l'éthanol, en séchant avec du gaz azote après chaque rinçage. Pour appliquer la protéine sur la lamelle imprimée, placez la lamelle dans une petite boîte de Pétri ou dans une chambre de culture cellulaire. Recouvrez de 500 microlitres à un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate Delcos (DPBS). La DPBS doit recouvrir complètement le substrat pendant l'incubation avec la protéine.

Pour assurer une couverture protéique uniforme, ajoutez une solution concentrée de protéine au DPBS et mélangez la solution en pipettant plusieurs fois. Incubez le mélange protéique avec le substrat à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation, rincez soigneusement le substrat avec du DPBS pour éliminer la protéine non liée, en prenant soin de ne pas dessécher le substrat ni de le faire passer à travers l'interface air-eau.

Après trois rinçages, aspirez le DPBS. Ensuite, ajoutez environ 500 microlitres de milieu de croissance cellulaire complet afin de maintenir un substrat humide. Remplacez le milieu de croissance utilisé pour rincer le substrat.

Avec un milieu frais, le substrat est désormais prêt à être ensemencé avec des cellules. Généralement, de 30 à 200 cellules par millimètre carré sont ensemencées sur le substrat. Cette image montre un tampon A-P-D-M-S visualisé au microscope en plaçant la face structurée du tampon vers le bas sur un couvre-objet en verre ; la barre d'échelle mesure 100 micromètres.

Un estampage correct donne lieu à un motif protéique net et bien défini, visible par l'application d'une protéine marquée par un fluorophore, comme la fibronectine marquée par le LOR 6 47. La restriction des cellules chk one au motif protéique est illustrée ici. Les barres d'échelle mesurent 100 micromètres dans ces images.

Alternativement, l'immunohistochimie peut être utilisée pour visualiser le motif protéique après fixation par SU. Ici, l'anticorps anti-lamine conjugué LOR trois 50 est utilisé pour visualiser la lamine en motif semée avec des neurones hippocampiques de souris E 18, observés après quatre jours in vitro. Les neurones hippocampiques de souris E 18 marqués avec le traceur MIT rouge cinq 80 montrent que la croissance cellulaire est bien confinée au motif protéique. Bien que cette technique soit facile à maîtriser, plusieurs problèmes courants peuvent survenir, comme illustré par ces préparations de substrats en motif visualisées par fibronectine conjuguée LOR 6 47.

L'application de la protéine sans mélange suffisant de la solution concentrée de protéine dans le DPBS peut entraîner des motifs protéiques irréguliers. Un estampage incorrect peut provoquer un transfert partiel du motif ou un effondrement du tampon. En outre, l'exposition du substrat imprimé contenant la protéine adsorbée à l'air peut perturber la monocouche, entraînant une résistance réduite.

En arrière-plan, le motif en immersion peut produire des structures présentant de petits détails difficiles à imprimer par lithographie microcontact conventionnelle dans l'air. Ces deux images montrent différentes régions du même motif imprimé à l’aide du même tampon en PDMS, soit dans l’air, soit dans l’eau déionisée ; des lignes de support sont indiquées sur l’image de gauche afin de montrer que seuls les petits détails du motif n’ont pas été correctement transférés. Les barres d’échelle représentent 20 micromètres. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 18 à 24 heures si elle est exécutée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer un substrat structuré. Produire un tampon A-P-D-M-S. Utiliser l'empreinte par contact microscopique pour préparer un substrat en or structuré et visualiser ce motif à l'aide de protéines et de cellules.