Lensless microscopie à fluorescence sur une puce

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une plateforme de microscopie fluorescente sans lentille sur puce permettant l'imagerie d'objets fluorescents sur un champ de vision extrêmement large. Pour ce faire, un filtre d'absorption mince et une plaque de face en fibre optique sont délicatement placés au-dessus d'un réseau de capteurs optoélectroniques, ou CCDC moss, puis une puce microfluidique est positionnée au-dessus de la plaque de face. Ensuite, un prisme est assemblé avec la micropuce à l'aide d'une huile d'immersion à index de réfraction adapté.

La fluorescence est excitée à travers la face latérale d'un prisme rhomboïdal et l'illumination holographique est réalisée par la face supérieure du même prisme. En fin de compte, des images microscopiques à haute résolution peuvent être obtenues à partir des images fluorescentes acquises en décodant les images brutes à l'aide d'algorithmes numériques. Si nécessaire, les objets fluorescents décodés peuvent être comptés automatiquement à l'aide d'une interface spécialement conçue.

Objectif sur puce. L'imagerie en général vise à remplacer les microscopes optiques encombrants basés sur des lentilles par des conceptions plus simples et plus compactes. Cette plateforme technologique émergente pourrait éliminer le besoin de composants encombrants et coûteux grâce à de nouvelles théories et à des algorithmes numériques de reconstruction.

La liste des lentilles sur la plateforme d'imagerie sur puce comprend plusieurs composants optiques, notamment un réseau de capteurs numériques, une source d'illumination incohérente, un prisme, un filtre d'absorption et une plaque de face en fibre optique, ou un convergent en fibre optique. Sur cette plateforme, différents types de réseaux de capteurs peuvent être utilisés pour la détection du signal fluorescent provenant d'objets microscopiques cibles. Aux fins de cette vidéo, un dispositif à transfert de charge sera utilisé ; une source de lumière incohérente, telle qu'une simple diode électroluminescente, est employée pour l'excitation de la fluorescence.

Deux méthodes différentes de filtrage d'excitation sont utilisées en parallèle pour créer le fond en champ sombre requis, comme illustré sur ce diagramme. Premièrement, un prisme en verre ou une hémisphère en verre est utilisé pour créer une réflexion totale interne, ou RTI, à la surface inférieure de la puce microfluidique qui contient les échantillons d'intérêt. Parallèlement à cela, un filtre d'absorption peu coûteux est utilisé pour éliminer les lumières d'excitation faiblement diffusées qui ne respectent pas le processus de RTI.

Après une réjection réussie de l'excitation grâce à ces deux mécanismes, seule l'émission fluorescente des échantillons est captée au niveau du plan du détecteur. Malgré une ouverture numérique de détection aussi élevée, les taches fluorescentes brutes sur le réseau de capteurs deviennent assez larges afin de faciliter la conception et un meilleur contrôle de la diffusion spatiale de ce signal fluorescent. Une plaque de face en fibre optique sera placée entre le plan objet et le plan capteur, en remplacement d'une plaque de face classique.

Une plaque de face en fibre optique conique, qui présente une densité nettement plus élevée de câbles en fibre optique sur sa facette supérieure par rapport à la facette inférieure, peut être utilisée pour une imagerie de résolution accrue grâce à l'agrandissement. Les puces microfluidiques utilisées dans cette plateforme sont fabriquées à l'aide de parois en polydiméthylsiloxane disposées sur des lames de verre afin de créer les microcanaux nécessaires au début de l'assemblage de la plateforme d'imagerie sur puce sans supports. Tout d'abord, retirez le verre de couverture du réseau de capteurs optoélectroniques à l’aide d’un stylo à vide, puis placez délicatement un filtre d’absorption mince sur la zone active du détecteur.

Placer une plaque de face en fibre optique au-dessus de ce filtre d'absorption. Ensuite, positionner la puce microfluidique fabriquée directement au-dessus du réseau de fibres optiques. Puis, assembler un prisme de verre au-dessus de la puce microfluidique en utilisant de l'huile d'adaptation d'indice, de sorte que l'indice de réfraction de l'interface corresponde à celui du verre.

Connectez les sources lumineuses à des câbles en fibre optique à l’aide de connecteurs FC. L’un des aspects les plus délicats de cette procédure est l’alignement des composants. Alignez soigneusement les distances entre les composants, la position et l’angle de l’éclairage.

Enfin, rapprochez la fibre d'illumination latérale du prisme et ajustez son angle afin de garantir une réflexion totale interne à l'interface verre-air correspondant aux puces microfluidiques. Ce dispositif sur puce permet d'observer divers types de cellules ou de petits modèles animaux sur le substrat inférieur ; toutefois, dans le cadre de cette démonstration, ce sont les globules blancs qui seront observés. Pour marquer les globules blancs avec un colorant fluorescent, mélangez d'abord environ 100 microlitres de sang total avec environ un millilitre de tampon d'hémolyse des globules rouges, incubez pendant environ trois minutes à température ambiante, puis centrifugez la solution sanguine.

Après avoir retiré la couche supérieure à l’aide d’une micropipette, resuspendre la couche de culot dans du tampon salin phosphate pour marquer l’acide nucléique des cellules avec un colorant fluorescent, ajouter du SYTO 16 à la suspension resuspendue, puis incuber l’échantillon environ 30 minutes à l’abri de la lumière à température ambiante. Après 30 minutes, centrifuger l’échantillon marqué. Retirer le surnageant afin de réduire le bruit de fond dû à l’émission fluorescente des colorants non liés.

Reese a redissous le culot de globules blancs dans environ cinq millilitres de PBS. L'échantillon est maintenant prêt à être chargé dans la puce microfluidique pour l'imagerie fluorescente sans lentille sur puce. Avant l'imagerie des globules blancs, la plateforme d'imagerie doit être étalonnée à l'aide de microbilles fluorescentes.

Préparer un échantillon dilué de microbilles en utilisant de l'eau déionisée et une solution brute de billes. À l'aide d'une seringue équipée d'une aiguille fine, injecter cet échantillon initial dans la puce microfluidique par le côté des parois en PDMS.

Après avoir assemblé les composants afin d'obtenir une imagerie fluorescente sur puce, acquérez des images brutes de billes fluorescentes à l'aide de l'interface LabVIEW personnalisée via un ordinateur. Vérifiez qu'au moins 20 images de billes fluorescentes isolées sont présentes sur l'ensemble du champ de vision. Enregistrez les données d'étalonnage, qui seront utilisées ultérieurement pour étalonner et extraire la fonction d'étalement du point de la plateforme de microscopie fluorescente sans objectif.

Retirez la puce microfluidique contenant l'échantillon de billes fluorescentes et détachez le prisme de cette puce. Injectez l'échantillon de globules blancs préparé précédemment dans une autre puce microfluidique inutilisée, par le côté des parois en PDMS. Réassemblez les composants une fois de plus dans les mêmes conditions expérimentales, en particulier en ce qui concerne les distances et la puissance d'excitation.

Acquérir les images brutes des globules blancs à l'aide du logiciel personnalisé LabVIEW, en utilisant les mêmes paramètres logiciels que ceux employés pour les microbilles fluorescentes. Les données de calibration et les images brutes des globules blancs sont ensuite utilisées pour créer des images de résolution plus élevée dans MATLAB par traitement numérique. Des résultats représentatifs d'imagerie fluorescente tout champ sur puce d'un mélange contenant des particules vertes fluorescentes de quatre micromètres et de 10 micromètres sont présentés ici à des fins de comparaison, microscope 10 x.

Des images objectives sont également fournies, qui correspondent bien aux images fluorescentes sans lentille présentées. Ensuite, des résultats d'imagerie fluorescente large champ sans lentille d'un mélange contenant des particules fluorescentes vertes de 10 microns et des particules fluorescentes rouges de 10 microns. Les images fluorescentes sans lentille offrent une concordance satisfaisante avec les images obtenues avec un objectif de microscope à 10x des mêmes échantillons.

Cette figure présente une comparaison des performances entre la déconvolution de Lucy Richardson et l'échantillonnage compressif fondé sur des algorithmes de décodage, pour l'imagerie de différentes paires de billes de 10 micromètres. La rangée supérieure illustre les images brutes fluorescentes sans lentille, dans lesquelles les images en encart montrent les comparaisons au microscope des mêmes particules, obtenues à l’aide d’un objectif 10 x. La rangée du milieu montre les résultats du décodage compressif, tandis que la rangée inférieure illustre les résultats de la déconvolution de Lucy Richardson. DDCS et DLR font respectivement référence aux distances centre à centre et aux images au microscope, aux images sans lentille décodées par CS, et aux images sans lentille déconvoluées par LR.

Ensuite, le traitement numérique des images brutes de la lentille, moins fluorescentes, est illustré. Un algorithme fondé sur un échantillonnage compressif est utilisé pour atteindre une résolution spatiale inférieure à quatre micromètres, en résolvant des paires de billes de deux micromètres de diamètre étroitement regroupées. Les encarts montrent des comparaisons avec un objectif de microscope 40 x, qui concordent très bien avec les images fluorescentes décodées.

Ici, D désigne les distances centre à centre dans les images microscopiques. Tandis que DCS fait référence aux distances centre à centre dans l'objectif CS décodé, images moins fluorescentes. Cette figure présente les résultats d'imagerie sans lentille de globules blancs marqués de manière fluorescente.

Les images brutes sans lentille sont rapidement décodées à l'aide d'un décodeur basé sur la CS, ce qui correspond très bien à une image obtenue avec un microscope conventionnel du même échantillon, acquise à l'aide d'un objectif 10 x. En complément de l'imagerie, si nécessaire, les objets fluorescents décodés peuvent également être comptés automatiquement à l'aide d'une interface spécialement conçue pour des applications de cytométrie sur puce. Une interface personnalisée et automatisée de comptage d'objets fluorescents sous Matlab est illustrée ici. Nous venons de démontrer la procédure de microscopie fluorescente sans lentille de cellules marquées et de micro-organismes sur un champ de vision de huit centimètres carrés.

Une plateforme d'imagerie de cellules comparée de ce type avec le décodeur compressif rapide en aval. Elle sera très variable pour des applications de cytométrie à haut débit, d'analyse de micro-organismes rares et de recherche sur des cellules réelles.