Une méthode de génotypage basé sur la PCR pour distinguer les variétés de type sauvage et les plantes ornementales de Imperata cylindrica

L'objectif principal de cette procédure est de fournir un protocole de génotypage moléculaire rapide et économique permettant de distinguer les variétés de Retta cylindrica, généralement appelée herbe gon, que l'on ne peut différencier par la morphologie seule. Cela est réalisé en identifiant et en isolant d'abord un tissu provenant d'une variété d'herbe gon d'intérêt. L'étape suivante consiste à extraire l'ADN nucléaire et plastidial du tissu collecté.

Une réaction de polymérase en chaîne est ensuite effectuée sur l'ADN extrait à l'aide d'amorces spécifiques aux variétés, ciblant les différences de séquence dans la région PLAs turn LF, ainsi que des contrôles positifs et négatifs appropriés. La dernière étape consiste à réaliser une électrophorèse sur gel pour chacune des quatre réactions PCR afin de visualiser les produits PCR amplifiés. En définitive, la variété de gazon gon prélevée est déterminée par l'analyse des bandes de produits PCR spécifiques aux variétés obtenues sur le gel. Les plantes invasives coûtent aux États-Unis environ 3,4 milliards de dollars par an, causant des dommages considérables aux ressources agricoles et naturelles.

L’imperata de type sauvage, également connue sous le nom de cogan, est l'une des dix mauvaises herbes invasives les plus nuisibles au monde. L’herbe cogan forme des peuplements monospécifiques à propagation rapide qui remplacent la végétation indigène, et par conséquent, les animaux dépendant de cette végétation indigène. À ce jour, l’herbe cogan infeste 490 millions d'hectares dans le monde et environ 500 000 hectares aux États-Unis. Une variété ornementale de ti de *tus centrica* est largement commercialisée sous les noms de tus centrica, Arbra, red Baren et Japanese blood crass, que nous appellerons JBG. Cette variété est présumée stérile et non envahissante, et est considérée comme désirable en raison de ses feuilles de couleur rouge.

Dans certaines conditions, l'herbe japonaise à sang peut produire des graines viables et revenir à une forme entièrement verte, indiscernable de l'herbe cogan sauvage. Comme vous pouvez le constater, elles possèdent toutes deux des feuilles vertes et sont plus grandes que la variété ornementale traditionnelle, avec des feuilles plus larges. De plus, les plantes réverties et de type sauvage ont des rhizomes plus gros que la variété ornementale, ce qui augmente leur potentiel de reproduction asexuée.

La réversion rend l'identification par la morphologie seule difficile. Les méthodes moléculaires offrent un moyen de distinguer avec précision les plantes envahissantes et les matériaux végétaux qui ne peuvent être identifiés par des moyens visuels classiques.

Les méthodes moléculaires sont essentielles pour prévenir la propagation et l'introduction de plantes invasives. L'application de ce protocole moléculaire permet de distinguer avec précision les formes réverties du ruban du Japon de l'herbe Kogan. Ce protocole peut aider à éviter la coexistence avec l'herbe Kogan et la formation éventuelle d'hybrides viables.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le polymorphisme de longueur de fragment amplifié, ou l'analyse A FLP, et des approches comme le séquençage de l'ADN, réside dans le fait qu'elle constitue une méthode de génotypage moléculaire très économique et rapide, capable de distinguer facilement le type sauvage de kogan grass des variétés de Japanese blood grass. La démonstration de la technique sera réalisée par Joseph Hery, un étudiant de licence de notre laboratoire. Commencez par identifier un spécimen provenant d'un site où le gon grass ou le Japanese blood grass poussent et doivent être différenciés l'un de l'autre.

L'herbe japonaise à sang est facilement distinguée de l'herbe sauvage de type gon par ses feuilles rouge vif. Cependant, le révert de l'herbe japonaise à sang est presque indiscernable de l'herbe Kogan, car les deux présentent des feuilles vertes plus longues, une surface foliaire plus étendue et des rhizomes plus gros que l'herbe japonaise à sang ornementale. Cette méthode peut être utilisée sur des tissus foliaires frais, congelés ou récemment séchés.

Si l'on prévoit de conserver des tissus pour une extraction d'ADN à une date ultérieure, la meilleure méthode consiste à congeler et à stocker immédiatement les tissus à moins 80 degrés Celsius. Si un stockage à sec est nécessaire, placer le tissu dans une enveloppe en papier et conserver l'enveloppe dans du gel de silice déshydraté ou un autre dessiccant actif à température ambiante. Si l'on utilise du tissu frais, s'assurer que l'extraction de l'ADN est effectuée dans les trois heures suivant le prélèvement afin d'éviter la dégradation.

Cette procédure utilise le mini-kits pour plantes DNEZ de Kyogen conformément aux instructions du fabricant, avec une légère modification. La procédure a été adaptée de manière à utiliser plus de 100 milligrammes de tissu frais ou congelé, ou plus de 20 milligrammes de tissu séché. Tout d'abord, broyez plus de 100 milligrammes de tissu foliaire frais ou congelé, ou plus de 20 milligrammes de tissu foliaire sec, en une poudre fine à l’aide de trois cycles d’azote liquide et d’un broyage dans un mortier et un pilon refroidis.

Prélevez le poids de la poudre congelée issue de tissus frais ou congelés en aliquotes de 100 milligrammes. Si vous utilisez du tissu foliaire sec, pesez la poudre en aliquotes de 20 milligrammes. Après cette étape, procédez à l'extraction de l'ADN conformément aux instructions du fabricant à l'aide d'un spectrophotomètre tel que le test au spectrophotomètre NanoDrop, ADN, qualité et quantité : les rendements d'ADN corrects doivent se situer entre 50 et 150 nanogrammes par microlitre, avec des rapports A260/A280 et A230/A280 proches de 2,0 comme indiqué ici.

Réalisez une électrophorèse en utilisant un gel standard à 1 % AROS. Vérifiez la présence de bandes relativement grandes de plus de 10 kb, sans ou avec peu de traînage dû à une contamination par l'ARN ; si la concentration en ADN est élevée, diluez les échantillons à 70 nanogrammes par microlitre pour les étapes suivantes. Les amorces de PCR utilisées dans ce protocole, indiquées par les flèches rouge et verte, sont conçues à partir des différences de séquence entre la région espacer LF du « plastered turn » du chiendent et les génotypes du chiendent japonais.

Ces différences se présentent sous forme de polymorphismes de nucléotides simples ainsi que d'insertions et de délétions indiquées par les flèches noires verticales, ce qui permet la conception d'amorces spécifiques à chaque variété. En plaçant les amorces au niveau des séquences uniques, les séquences d'amorces sont indiquées dans la partie écrite du protocole ; pour chaque échantillon d'ADN isolé, préparer deux réactions PCR de 50 microlitres dans des tubes PCR de 0,2 millilitre à paroi fine, sur de la glace, en utilisant chaque jeu d'amorces conformément au protocole écrit. Si la concentration en ADN est faible, on peut ajouter davantage d'ADN à chaque réaction, tout en ajustant la quantité d'eau doublement distillée et sans nucléase afin que le volume total de la réaction reste de 50 microlitres.

Ne pas utiliser plus de cinq microlitres d'ADN ou plus de 10 % du volume total par réaction, car les impuretés présentes dans les échantillons d'ADN pourraient inhiber les réactions de PCR. Afin de s'assurer que tous les réactifs de PCR fonctionnent correctement, préparer soigneusement le témoin positif. À l'aide des amorces du témoin positif, préparer également le témoin négatif en utilisant le même jeu d'amorces contrôle que pour le témoin positif, mais en remplaçant l'ADN extrait par de l'eau doublement distillée. À ce stade, on obtient un total de quatre réactions de PCR pour chaque échantillon testé. Ensuite, réaliser les amplifications par PCR dans un thermocycleur équipé d'un couvercle chauffant, en suivant les paramètres de cyclage indiqués dans le protocole écrit. Une optimisation de la température de recuit des amorces, des temps d'extension et du nombre de cycles peut être nécessaire, selon la qualité de l'ADN, des amorces, de la polymérase utilisée ou du type de thermocycleur.

Une fois les réactions de PCR terminées, séparer les produits de PCR sur un gel à 1 % en utilisant une électrophorèse standard. Faire migrer les échantillons à environ 120 volts jusqu'à ce que le front D atteigne les trois quarts de la longueur totale du gel. Visualiser le gel sous lumière UV et examiner les bandes obtenues pour vérifier si un fragment d'ADN approprié a été amplifié.

Ce gel représentatif montre les résultats de l'électrophorèse de produits de PCR obtenus à partir d'échantillons d'ADN de Kogan grass, de Japanese blood grass et de Japanese blood grass revert, combinés à des amorces spécifiques de Kogan grass et de JBG, ainsi qu'un contrôle positif turn LF et un contrôle négatif sans matrice. Le jeu d'amorces du contrôle positif turn LF fonctionne également bien pour Cogan grass, Japanese blood grass, Japanese blood grass revert et d'autres graminées, et produit une bande de 890 paires de bases. Si tous les réactifs de PCR sont exempts de contaminants d'ADN, la réaction du contrôle négatif ne produira pas de produit de PCR.

Si l'échantillon d'ADN provient de la graminée sauvage Kogan, une réaction PCR utilisant le jeu d'amorces spécifique à la graminée Kogan produira une seule bande d'environ 595 paires de bases, tandis que les amorces spécifiques à JBG ne produiront aucune bande. De même, si l'échantillon d'ADN provient de JBG ou d'une réaction J-B-G-A-P-C-R révertie, l'utilisation du jeu d'amorces spécifique à JBG produira une seule bande d'environ 594 paires de bases. Alors que les amorces spécifiques à la graminée Kogan ne produiront aucune bande.

Étant donné que JBG et JBG réverti possèdent la même séquence d'acide nucléique, ils auront donc des profils de bandes identiques. Toutefois, les différences morphologiques entre JBG et les réversions de JBG sont assez évidentes ; ainsi, bien que les résultats de PCR soient identiques, les variétés de JBG sont faciles à distinguer au niveau de la plante. Le séquençage de l'ADN des produits de PCR peut permettre d'identifier d'éventuelles modifications des séquences d'ADN chez différents écotypes de chiendent.

Le développement de cette technique fournit la première méthode moléculaire simplifiée permettant de distinguer avec précision la forme sauvage de K et l'herbe ainsi que la forme rétablie de sa variété ornementale Japanese blood grass. Nous encourageons les utilisateurs de ce protocole à nous contacter afin de rapporter les résultats obtenus à partir de l'utilisation de ce protocole. Ces informations partagées permettront d'obtenir des données sur la répartition de Japanese blood grass.

Cela aidera également les régulateurs du USDA à prendre des décisions éclairées concernant les mesures qui pourraient être nécessaires pour éviter la propagation et l'hybridation potentielle des variétés très invasives de l'herbe Cogan.