Essai de superposition des protéines membranaires: Un protocole pour tester l'interaction entre les protéines solubles et insolubles In vitro

Test de la protéine. L'interaction entre protéines est indispensable à l'analyse de leur fonctionnalité. Cette vidéo présente un test de liaison entre protéines in vitro afin d'évaluer l'interaction entre une protéine membranaire immobilisée et une protéine soluble.

Tout d'abord, les protéines de fusion sont clonées, exprimées et extraites. La protéine insoluble marquée est immobilisée sur une membrane en nitrocellulose et traitée pour être repliée dans sa conformation native. La membrane est ensuite sondée avec des protéines solubles marquées et un immunoblot est réalisé pour détecter les protéines.

Si les protéines marquées interagissent, elles sont capturées par la protéine immobilisée sur la membrane, et le signal provenant du transfert immuno-chimique sera observé. Ainsi, ce test constitue une méthode fiable pour analyser l'interaction entre une protéine insoluble et une protéine en solution. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le tirage à l'aide de GST, réside dans la possibilité d'évaluer de manière fiable la liaison entre une protéine insoluble et une protéine soluble in vitro.

La première étape de cette procédure consiste à produire des protéines marquées génétiquement pour leur détection. Commencez par cloner la protéine qui sera immobilisée sur la membrane. On se référera à cette protéine comme pro Im pour protéine immobilisée, dans un vecteur d'expression codant une grande étiquette telle que GST ; le vecteur d'expression vide, qui code uniquement pour l'étiquette, sera utilisé comme contrôle négatif de la protéine immobilisée et est désigné par pro IM nc.

Ensuite, cloner la protéine qui sera utilisée comme sonde soluble dans un vecteur d'expression, codant pour une étiquette différente telle que strep deux. Cette construction sera désignée sous le nom de prosol pour protéine soluble servant de contrôle négatif ; cloner une protéine soluble de contrôle négatif dans le même vecteur d'expression. Cette construction sera désignée sous le nom de Prosol NC pour protéine soluble contrôle négatif.

Ensuite, utiliser un système d'expression protéique tel qu’*E. coli* ou un virus baculovirus pour exprimer les protéines marquées. Le système d'expression utilisé doit être soigneusement choisi en fonction des besoins en modifications post-traductionnelles. Extraire les protéines exprimées à partir de l'organisme choisi. Pour pro IM et pro I mnc Resus.

Suspendez les cellules dans un tampon de charge pour électrophorèse SDS-PAGE contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases. Ensuite, faites bouillir les cellules pendant cinq minutes, puis centrifugez-les pour éliminer le précipité afin d'extraire le Prosol et le prosol NC. Utilisez des procédures standard. Le pro IMS peut être extrait dans des conditions dénaturantes, car les protéines seront repliées après leur immobilisation sur la membrane en nitrocellulose.

Cependant, le prosol doit être extrait afin d'obtenir une conformation native, car il sera ajouté au tampon de liaison une fois que les protéines marquées auront été extraites. Déterminez la concentration des protéines recombinantes à l'aide d'une méthode standard, comme le kit de dosage des protéines BioRad. Si un extrait brut plutôt qu'une protéine purifiée doit être utilisé pour le dosage.

Estimez la concentration de la protéine d'intérêt par densitométrie d'analyse de la bande correspondante sur un gel de polyacrylamide SDS coloré au kumasi, en utilisant des concentrations connues de BSA comme référence. Tracez ensuite la courbe standard à partir des intensités de signal mesurées par densitométrie d'analyse de la BSA et calculez la quantité de protéine contenue dans l'extrait brut.

L'étape suivante de la procédure consiste à immobiliser les extraits de pro Iam et de pro IAM NC sur la membrane. Commencez par charger un microgramme de chaque extrait, pro Iam et pro IAM NC, en double sur un gel de polyacrylamide-SDS. Après électrophorèse, retirez le gel des plaques de verre et placez-le dans 100 millilitres de tampon de transfert, puis incubez avec agitation douce pendant 20 minutes à température ambiante.

Après l'incubation, réalisez un immunotransfert pour transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose, puis laissez les protéines fixées sur la membrane se replier. Placez la membrane dans 15 millilitres de tampon A et incubez-la sous agitation douce. Pour éliminer le SDS résiduel, incubez pendant 15 minutes à température ambiante sous agitation douce.

Après l'incubation, retirez soigneusement la membrane du tampon. Ensuite, placez la membrane dans 25 millilitres de tampon de dénaturation. Incubez pendant deux heures à température ambiante avec une agitation douce.

Pendant l'incubation, la membrane en nitrocellulose deviendra opaque. Ensuite, à l’aide de pinces, transférez la membrane dans 25 millilitres de TBS et incubez avec agitation douce pendant cinq minutes. Au cours de cette étape, la membrane retrouve sa couleur blanche d'origine.

Ensuite, transférez la membrane dans 25 millilitres de tampon de liaison. Incubez à quatre degrés Celsius avec agitation douce pendant toute la nuit. Ensuite, la protéine soluble sera utilisée pour sonder la membrane afin de détecter la protéine immobilisée.

Tout d'abord, préparez les tampons d'hybridation en diluant de un à dix microgrammes de prosol et de prosol NC dans des tubes séparés contenant chacun 10 millilitres de tampon de liaison frais. Ensuite, transférez le tampon dans un sachet d'hybridation. Puis, découpez la membrane en deux bandes, chacune contenant pro IM et pro IAM nc.

Ces membranes seront placées dans le tampon d'hybridation. Transférez chaque membrane dans la solution d'hybridation prosol ou prosol NC et incubez pendant 1,5 heure à température ambiante avec une agitation douce. Retirez les membranes des solutions d'hybridation et rincez-les trois fois pendant 15 minutes dans le TBS.

Pour visualiser les interactions entre protéines, bloquez la membrane avec du lait écrémé à 2,5 % dans du TBST pendant une heure. Après l'incubation, placez les membranes bloquées dans la solution d'anticorps primaire. Ici, on utilise un anticorps polyclonal anti-strep deux de lapin.

Incuber pendant une heure à température ambiante avec agitation douce après l'incubation. Rincer les membranes dans 20 millilitres de TBST pendant 15 minutes, puis deux fois pendant cinq minutes à température ambiante avec agitation douce. Ensuite, placer les membranes dans la solution d'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (HRP). Ici, un anticorps anti-IgG de lapin conjugué à la HRP est utilisé.

Incuber pendant une heure à température ambiante avec agitation douce. Rincer les membranes dans 20 millilitres de TBST pendant 15 minutes, puis deux fois pendant cinq minutes à température ambiante avec agitation douce comme précédemment ; après le rinçage final dans du TBS, visualiser l'interaction entre protéines à l'aide d'un substrat chimiluminescent HRP de Millipore. Im Molan Western Chemiluminescent.

Le substrat de la PRH est utilisé après le transfert immunitaire du prosol. Rincer la membrane avec du TBST pendant 15 minutes, puis deux fois pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, re-probéger les membranes avec l'anticorps primaire dirigé contre la marque du pro.

Incubez avec l'anticorps secondaire approprié. Visualisez le PRO I et le pro Im NNC en détectant la chimiluminescence afin de valider l'identité des bandes obtenues dans le test de superposition sur membrane protéique. L'interaction entre les protéines A et K et les protéines YFP et MP CYFP a été évaluée dans des cellules épidermiques de tabac en utilisant la méthode décrite dans cette vidéo, comme illustré ici.

Lorsque la complémentation de fluorescence biomoléculaire a été évaluée, un signal YFP intense a été reconstitué. Ce signal BFC s'est accumulé dans les Punta situées à la périphérie cellulaire, ce qui est caractéristique du plasma, car MP est une protéine très insoluble. Lorsqu'elle est exprimée dans des bactéries ou des plantes, une analyse de recouvrement membranaire a été adoptée pour valider cette interaction.

Des extraits protéiques in vitro contenant un microgramme de GST MP ou de GST non fusionné ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS, suivie d'un transfert électrophorétique sur membrane de nitrocellulose. Lorsque ces protéines ont été hybridées avec du GST MP soluble marqué strep deux, seul le GST MP, et non le GST non fusionné, a montré une liaison. De plus, lorsque le même jeu de protéines a été hybridé avec une protéine non apparentée, la kinase NADH cytoplasmique d'Arabidopsis marquée strep deux, aucune liaison n'a été observée, ce qui démontre davantage la spécificité de l'interaction A NK MP. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien reconstituer les protéines immobilisées conformément au protocole présenté.