Cartographie optique de potentiels d'action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

L'objectif général de cette procédure est de cartographier simultanément le potentiel transmembranaire et le transitoire calcique intracellulaire dans des cœurs de souris isolés et perfusés intacts avec du LOR. Cela est réalisé en excisant d'abord le cœur de souris intact, puis en canulant l'aorte et en commençant la perfusion au LOR. L'étape suivante consiste à immobiliser le cœur en chargeant un coupleur excitation-contraction, puis en épinglant le cœur dans la chambre de perfusion.

Les dernières étapes consistent à charger les colorants optiques et à effectuer les préparatifs afin de réduire les artefacts de mouvement pendant l'expérience. Les images optiques sont obtenues en capturant la lumière émise par le cœur à l'aide de caméras my cam Ultima LC Moss. Hé, je m'appelle di.

Je suis étudiant diplômé à l'Université de Washington. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'électrode microscopique, est que la cartographie optique permet une résolution spatiale plus élevée sur toute la surface du cœur. Salut, je suis Matt Sulkin.

Je suis étudiante diplômée à l'Université de Washington. Cette méthode, si elle est correctement réalisée, peut aider à répondre à de nombreuses questions en électrophysiologie cardiaque, comme les bases de l'arythmogenèse. Commencez par configurer une pompe péristaltique pour faire circuler les solutions à 40 millilitres par minute.

Ensuite, régler une deuxième pompe péristaltique à 80 millilitres par minute. Cette pompe renvoie le Perfuse huit au réservoir de maintien et d'oxygénation. Mettre en marche les pompes et rincer le système avec un litre d'éthanol à 70 % pendant 30 minutes en recirculation.

Suivez ce lavage par deux litres d'eau déionisée sans recirculation. Une fois l'eau évacuée, faites circuler deux litres de solution de Tyro et faites-la passer à travers un filtre de cinq microns. Réchauffez le perfusat de huit à 37 degrés Celsius à l'aide d'une double enveloppe chauffante et d'un circulateur, et barbotez un gaz oxygéné dans la solution.

Régler le débit de bulles de gaz pour maintenir le pH à 7,35 ± 0,05. Surveiller le pH et la température pendant l'expérience. L'appareil de cartographie optique double est constitué de deux caméras C moss haute vitesse capables de capturer une image de 100 sur 100 pixels à raison de 3000 images par seconde.

Fixer un filtre passe-bande à la caméra d'imagerie calcique et un filtre passe-haut à la caméra d'imagerie de voltage sur un support double caméra. Placer un miroir dichroïque et une lentille de sorte que la lumière d'émission provenant du cœur soit focalisée sur le miroir par la lentille. Fixer également deux caméras au support et les positionner de manière à ce qu'elles soient perpendiculaires l'une par rapport à l'autre.

Ensuite, configurez la lumière d'excitation. La lumière est produite par une lampe halogène et dirigée à travers un guide lumineux flexible. Faites passer la lumière à travers un filtre thermique, un obturateur pour limiter l'exposition, et un filtre passe-bande d'excitation.

Enfin, préparez les électrodes d'argent et de chlorure d'argent en les installant dans la chambre. Après avoir vérifié et ajusté soigneusement les niveaux sur les amplificateurs et les filtres, le dispositif est prêt à recevoir un cœur. Utilisez un cocktail de kétamine et de xylazine contenant 100 unités d'héparine pour anesthésier une souris avant de poursuivre.

S'assurer que l'animal ne présente aucun réflexe de douleur en pinçant un orteil. Après avoir pratiqué une incision médiane au niveau du sternum, retirer rapidement le cœur et les tissus environnants. Puis, à l'aide d'un microscope stéréo et rapidement, identifier l'aorte et effectuer une coupe nette de l'aorte ascendante en dessous de l'artère subclavière droite.

Fixez maintenant un court segment d'aorte à une canule personnalisée de 21 g à l'aide de quatre fils de soie noirs tressés. Après la canulation, perfusez et superperfusez rétrogradement le cœur. À l'aide de la solution de Tyro, ajustez le débit pour maintenir la pression aortique entre 60 et 80 millimètres de mercure, mesurée par un transducteur de pression.

Dissez maintenant et retirez le tissu pulmonaire, le thymus et le tissu adipeux environnants. Insérez ensuite un tube en silicone dans le ventricule gauche par les veines pulmonaires. Suturez le tube au tissu conjonctif voisin.

Cette étape très importante empêche l'engorgement et l'acidification du Perfuse eight piégé dans le ventricule gauche, en particulier après la suppression des contractions ventriculaires. Pour éviter les mouvements cardiaques induits par le Perfuse eight, épingler le cœur au fond de la chambre de perfusion recouverte d'un revêtement protecteur au niveau de son apex. En outre, étirer et fixer les oreillettes droite et gauche afin d'augmenter la surface de contact des oreillettes dans la configuration verticale.

Cela maximisera la surface d'enregistrement. Pour effectuer les stimulations de stimulation, fixez une électrode sur mesure à la surface du cœur. Pour réduire les artefacts de mouvement, fixez un petit verre de couverture au-dessus du cœur à la surface de la solution.

Procédez en insérant le verre entre plusieurs broches. En guise de préparatifs finaux, focalisez la lumière d'excitation sur le cœur et positionnez les caméras pour obtenir une image optique, puis commencez le chargement du colorant tout en chargeant les colorants. Surveillez continuellement les enregistrements de l'ECG afin de garantir un fonctionnement électrique normal du cœur.

Commencez par réchauffer les BLEs statine à température ambiante. Mélangez ensuite un demi-millilitre de BLEs statine dans les huit profus du réservoir de stockage, et diluez le dixième de millilitre restant de BLEs statine dans un millilitre de solution Tyros. Au cours des 20 minutes suivantes, injectez lentement les BLEs statine dans le Tyros par un port d'administration situé près de la canule.

Le statine BLE réduira progressivement l'artéfact de mouvement. Ensuite, diluez 30 microlitres de colorant sensible à la tension dans une solution de tyro de un millilitre, puis injectez lentement ce mélange sur une durée de cinq à sept minutes dans le même port d'administration du médicament. Préparez ensuite à nouveau le même mélange.

Cette fois, ajouter 30 microlitres supplémentaires d'indicateur calcique. Appliquer lentement ce mélange sur cinq à dix minutes par le même orifice. Après l'injection de l'indicateur calcique, attendre encore cinq à dix minutes afin que la statine BLE supprime complètement le mouvement et que les colorants pénètrent dans les cellules avant de poursuivre l'expérience.

Cette préparation cardiaque a été réalisée. Selon le protocole, les signaux d'ECG ont été enregistrés pendant le balisage ventriculaire à partir d'une stimulation S1-S1. Des potentiels d'action et des signaux transitoires de calcium ont été enregistrés à partir des oreillettes situées à gauche et des ventricules situés à droite.

La flèche indique l'endroit où la diffusion du signal provenant des ventricules s'est produite. En regroupant les enregistrements de la caméra par unités de trois pixels sur trois pixels, un réseau de transitoires calciques et de potentiels d'action peut être affiché à partir des données du tableau. Une figure illustrant la conduction du potentiel d'action peut être établie. Les données provenant de trois points consécutifs sur les axes transversal et longitudinal montrent la variation de l'amplitude伴随ée à la propagation du potentiel d'action à la surface d'un ventricule.

De même, une figure montrant les durées du potentiel d'action et des transitoires calciques peut être établie. Elle illustre une condition contrôle à gauche et, à droite, une injection d'isoprénaline administrée au cœur, qui réduit nettement la durée des transitoires calciques et des potentiels d'action.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures en suivant cette procédure. D'autres méthodes, comme le protocole de stimulation, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple sur la période réfractaire du nœud auriculo-ventriculaire.