Construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le C. elegans

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment assembler et aligner un système d'ablation laser pour l'étude de la régénération des axones chez les CL gans. Cela s'accomplit tout d'abord en montant sur une platine optique un miroir tournant, une lame à demi-onde, un polariseur, un miroir de périscope et un rail avec miroir. L'étape suivante de la procédure consiste à aligner le faisceau laser avec le faisceau sortant provenant de l'objectif condenseur du microscope.

Ensuite, l'objectif agrandisseur du faisceau laser est monté, aligné et positionné afin de centrer le faisceau laser et de le rendre non divergent. La dernière étape de la procédure consiste à rendre le point d'ablation laser congruent avec le foyer de l'image en effectuant des réglages fins. En définitive, il est possible de sectionner précisément des axones d'une demi-micron avec un dommage tissulaire collatéral minimal à l'aide d'un faisceau laser limité par la diffraction, lorsque l'alignement NC XY est imparfait.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les lasers femtosecondes, est qu'elle est relativement peu coûteuse, à 15 000. Elle nécessite peu d'entretien et permet une coupe très précise des axones. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la régénération des axones chez la méduse *Aurelia*, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les mouches, le poisson zèbre, la souris, le système nerveux périphérique et les cellules en culture in vitro.

Fondamentalement, toute cellule située à moins de 30 à 50 micromètres de la surface. Commencez par positionner les composants sur la platine d'essai, puis fixez à l'aide de vis le support du périscope laser et les supports surélevés du rail. Ce système utilise un laser de classe 3B, qui peut facilement endommager les yeux ; veuillez donc prendre très au sérieux les consignes de sécurité relatives au laser.

Parlez à quelqu’un de votre département de physique local de la manière de manipuler en toute sécurité les lasers à faisceau libre. Pendant tout le processus d’alignement, réglez toujours le laser à la puissance la plus basse. Lorsque vous regardez à travers les oculaires, assurez-vous que le laser est obturé mécaniquement et qu’il est éteint.

Maintenant, positionnez d'abord le microscope, en l'alignant sur l'axe du rail. Deuxièmement, alignez-le avec le faisceau lumineux transmis provenant de l'objectif condenseur du microscope. Troisièmement, alignez les deux extrémités du rail avec le faisceau du condenseur à l'aide d'un diaphragme réglable ou d'une lentille fixée au rail.

Utilisez un niveau et des cales de laboratoire pour ajuster la hauteur du rail avant de poursuivre. Assurez-vous que les deux extrémités du rail sont alignées. Vérifiez maintenant que le faisceau laser traverse la glande, le polariseur de Thompson et la lame demi-onde, sans toucher leurs bords en rotation.

La plaque à demi-hauteur ajustera la puissance du laser une fois tous les composants fixés sur la platine optique. Allumez le laser, réglez la fréquence d'impulsion sur 100 en mode continu et réduisez la puissance au minimum à l'aide de la plaque à demi-hauteur. Utilisez un papier autocollant ou du papier pour lentilles afin de visualiser le faisceau laser.

À présent, dirigez le faisceau laser depuis la platine optique. Réglez et fixez successivement les miroirs montés de manière cinématique, en partant du laser, afin de guider le faisceau jusqu’au miroir fixé à l’extrémité du rail surélevé. Une fois terminé, le faisceau laser doit être approximativement aligné sur le centre des miroirs, et les miroirs doivent être orientés à environ 45 degrés par rapport à l’axe du faisceau laser, avant d’aligner ce dernier avec le faisceau lumineux transmis du microscope.

Retirez ou ouvrez tous les filtres ND et diaphragmes présents dans le module intermédiaire. Nous allons maintenant commencer l'étape la plus critique, qui consiste à réaliser une coupe précise des axones sans dommages collatéraux excessifs. Nous allons aligner précisément le laser selon les axes x, y et z, avec la puissance laser la plus faible possible afin d'obtenir le plus petit spot d'ablation.

Le faisceau laser et les faisceaux lumineux transmis peuvent être observés simultanément sur du papier. Placez le papier près de l'oculaire du microscope pour commencer. Procédez maintenant à l'alignement du laser à l'aide des réglages grossiers du miroir situé en haut du périscope et de celui situé à l'extrémité du rail.

Placer une feuille de papier entre la lentille condensatrice alignée et la tourelle d'objectifs ouverte. Continuer à utiliser les réglages fins du miroir sur le rail pour aligner le faisceau laser au centre du faisceau lumineux transmis plus large. Fixer maintenant le microscope en place à l'aide de pinces.

Des étapes supplémentaires concernant l'évaluation de l'alignement du laser sont disponibles dans le manuscrit écrit. Des dilatateurs de faisceau galiléens doubles doivent être installés afin d'élargir le faisceau laser de 300 microns de 33 fois pour remplir l'ouverture arrière de l'objectif de 10 millimètres. Commencez par monter les quatre lentilles sur des supports.

Ensuite, fixez les lentilles sur le rail de manière à ce qu'elles soient toutes alignées sur le même axe optique et parfaitement orthogonales au faisceau laser. Allumez le laser et réglez-le à la puissance minimale et en mode continu. Ajustez grossièrement l'alignement du faisceau à travers chaque lentille.

Utilisez du papier pour visualiser le faisceau. Éteignez maintenant le laser. Appliquez un obturateur de sécurité sur le laser et retirez le microscope du trajet du faisceau laser.

Réallumez le laser et visualisez-le sur un mur voisin. Utilisez le réglage fin des lentilles pour élargir le faisceau. Ajustez ensuite les deux derniers miroirs montés cinématiquement afin d’aligner le faisceau en un cercle de luminosité uniforme à la position estimée de l’ouverture arrière de l’objectif.

Observer la taille et l'uniformité du faisceau sur du papier. Ensuite, régler le faisceau à une convergence nulle en notant comment la taille du faisceau change lorsque l'on éloigne le papier de la lentille. Éteindre le laser et fermer l'obturateur mécanique.

Faites glisser le microscope dans le trajet du faisceau laser à l'aide des pinces fixes pour définir l'alignement correct. Remettez en place les pinces du côté libre du microscope, mais ne les serrez pas complètement. Allumez maintenant le laser.

Retirer le volet de sécurité et faire tourner le tourelle d'objectif vers une position ouverte à l'aide d'une feuille de papier sur la platine ; un faisceau laser élargi et uniforme, centré sur le faisceau lumineux transmis provenant du condenseur, doit être visible. Si le faisceau n'est pas centré, ajuster le centrage en desserrant les pinces du microscope et en déplaçant délicatement le microscope. Ensuite, refermer le volet de sécurité et régler le laser en mode déclenchement.

Placer l'objectif de 60 fois en position. Observer maintenant l'image des rayures de surface sur une lame cible. Retirer le volet de sécurité, déclencher le laser d'ablation et régler la puissance du laser pour obtenir le spot d'ablation minimal.

La tache doit être circulaire et située à cinq à 10 micromètres du centre de l'image, c'est-à-dire du centre de la tache d'ablation. En utilisant les réglages fins du miroir de rail monté cinématiquement pour maintenir la tache centrée et le profil du faisceau uniforme, il sera nécessaire de régler de manière itérative le miroir monté sur le rail et le miroir supérieur du périscope. Évaluer la mise au point Z du laser en déplaçant systématiquement la mise au point vers le haut et vers le bas par paliers d'un micron, en déclenchant le laser d'ablation à chaque étape.

Si le faisceau est correctement agrandi, aligné et que sa convergence est correctement ajustée, alors il devrait ablater de manière maximale au foyer de l’image et faiblement, voire pas du tout, à un micron au-dessus ou au-dessous du foyer. Si le point d’ablation maximal se trouve au-dessus ou au-dessous du foyer de l’image, effectuez les réglages finaux du focus Z du faisceau élargi en déplaçant la lentille L3 du télescope galiléen jusqu’à ce que l’ablation laser coïncide avec le foyer de l’image. Des nématodes ont été montés sur une lame personnalisée et des axones ont été ablatés à l’aide du système construit. La laser exo somie et l’imagerie en enregistrement temporel de la régénération des axones étaient très robustes.

À l’aide d’un dispositif motorisé, il était possible de couper et d’imager de manière routinière et précise cinq axones chez cinq animaux différents sur une même lame. Le temps d’imagerie des axones constituait le facteur limitant.

Environ 10 % des expériences ont produit des films en prise de vue instantanée de haute qualité. Les expériences restantes ont toutes fourni des données satisfaisantes, mais étaient moins esthétiques en raison de légers mouvements saccadés du ver, qui commençaient généralement après cinq à huit heures d'immobilisation. Lors de la réalisation de cette procédure, il est toujours essentiel d'évaluer précisément l'alignement du laser selon les axes x, y et Z.

Le problème le plus fréquent que rencontrent les personnes tentant de sectionner un axone est les dommages collatéraux ou l'incapacité totale de sectioner les axones, et ceci est presque toujours dû à un laser mal aligné. Ce système d'ablation laser et cette technique de visualisation de la régénération axonale chez C. elegans vous permettront d'analyser systématiquement l'effet de toute mutation génétique sur la régénération axonale. NCL C. elegans.