Construction d'un hydrogel de collagène pour la prestation de souches microsphères Cell-chargé Chitosan

Ce protocole propose une stratégie in vitro permettant d'acheminer des cellules souches à partir de microsphères de chitosane vers un support tridimensionnel en gel de collagène, puis de les récolter et de les cultiver. Les cellules souches adipeuses primaires émulsifient ensuite et récupèrent une préparation de microsphères de chitosane. Ensuite, les cellules souches sont ensemencées sur les microsphères de chitosane et cultivées dans un insert de plaque de culture doté d'une membrane dont la taille des pores est de huit microns, afin de produire un CSM chargé en CS. Enfin, le système d'acheminement par microsphères est mélangé à un support tridimensionnel en gel de collagène.

En fin de compte, ce système de MCS offre un potentiel d'utilisation en médecine régénérative et pour la délivrance de médicaments. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'injection de cellules ou la microencapsulation réside dans la capacité des cellules à s'attacher à un matériau porteur et à persister après l'application initiale. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car les microsphères d'esan possèdent une charge électrostatique intrinsèque.

Et le chargement des cellules au-dessus d'un lit de microbilles sera difficile sans les perturber. Excisez et lavez le tissu adipeux péri- et épidermique à partir d'un hachis de tissu, puis transférez un à deux grammes dans 25 millilitres de HBSS contenant 1 % de FBS. Après centrifugation, récupérez la couche de tissu adipeux en flottaison libre dans un ballon Erlenmeyer de 125 millilitres.

Ajoutez 25 millilitres de collagénase de type deux et incubez la réaction sur un agitateur orbital. Retirez maintenant soigneusement la fraction liquide située sous la couche d'huile et de tissu adipeux, puis filtrez-la successivement à l'aide de filtres en maille de nylon de 170 microns. Récupérez les cellules par centrifugation après deux lavages avec 25 millilitres.

HBSS Resus, suspendre le culot dans 30 millilitres de milieu de croissance Mesen Pro supplémenté. Répartir les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux purifiées dans deux flacons de culture T 75 et amplifier la préparation de CSM dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Ce protocole de CSM est un procédé d'émulsification eau dans huile qui utilise une technique par coacervation ionique.

Émulsifiez six millilitres d'une solution aqueuse de chitosane dans 100 millilitres d'un mélange de phase huileuse à l'aide d'un agitateur mécanique et d'un agitateur magnétique en tournant simultanément dans des directions opposées pendant une heure afin d'obtenir une émulsion stable entre l'eau et l'huile, puis ajoutez 1,5 millilitre de solution à 1 % d'hydroxyde de potassium dans l'octanol toutes les 15 minutes pendant quatre heures. Une fois la réaction de réticulation ionique terminée, décantez lentement la phase huileuse et ajoutez immédiatement les sphères à 100 millilitres d'acétone. Lavez les sphères avec de l'acétone jusqu'à ce que la phase huileuse soit complètement éliminée.

Ensuite, séchez les sphères récupérées sous vide. Séchez-les pour déterminer la taille moyenne des particules de CSM, la surface spécifique par milligramme et le volume cubique unitaire à l’aide d’un analyseur de taille de particules. Procédez ensuite à trois lavages du CSM avec de l’eau stérile afin d’éliminer les sels résiduels.

Maintenant, stérilisez la préparation de CSM à l’alcool absolu pour une utilisation en expérimentation cellulaire dans un tube en verre de 50 millilitres, mélangez cinq milligrammes de microsphères avec un millilitre de solution de TNBS 0,5 %, puis incubez pendant quatre heures à 40 degrés Celsius. Ajoutez ensuite trois millilitres d’acide chlorhydrique six normal et incubez à 60 degrés Celsius pendant deux heures. Après refroidissement des échantillons à température ambiante, ajoutez cinq millilitres d’eau déionisée et 10 millilitres d’éther éthylique.

Pour extraire le TNBS libre, prélevez un aliquot de cinq millilitres de la phase aqueuse et chauffez à 40 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 15 minutes afin d'évaporer tout éther résiduel après refroidissement à la température ambiante. Diluez avec 15 millilitres d'eau à l'aide d'un spectrophotomètre. Mesurez l'absorbance des microsphères de chitosane préparées à 345 nanomètres en utilisant le TNBS comme blanc.

Mesurez également le chitosane utilisé pour la préparation du CMS. Calculez maintenant le nombre de groupes amines libres du CMS par rapport au nombre total de groupes amines dans le chitosane. Équilibrez cinq milligrammes du CMS stérilisé dans du HBSS stérile pendant toute une nuit.

Transférez le milieu de culture standard (CSM) dans un insert de membrane de huit micromètres destiné aux plaques de culture de 24 puits. Une fois que le CSM s'est déposé, aspirez soigneusement le HBSS. Ajoutez ensuite 300 microlitres de milieu de croissance à l'intérieur de l'insert et 700 microlitres de milieu de croissance à l'extérieur de l'insert. Resus.

Suspendez les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux dans 200 microlitres de milieu de croissance et ensemencez-les sur la membrane CSM à l'intérieur de la plaque de culture. Incubez pendant 24 heures dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Transférez la membrane CSM chargée de cellules souches dans un tube stérile de microcentrifugeuse sans perturber les cellules ayant migré dans la membrane de l'insert.

Retirez maintenant le milieu résiduel et ajoutez 250 microlitres de milieu de croissance frais dans chaque tube. Ajoutez 25 microlitres de solution de MTT à cinq milligrammes par millilitre et incubez pendant quatre heures. Retirez les milieux et ajoutez 250 microlitres de diméthylsulfoxyde ; vortexez pour solubiliser le formazan. Centrifugez le CSM à 2 700 ×g pendant cinq minutes.

Mesurez l'absorbance du surnageant à 570 nanomètres en utilisant 630 nanomètres comme référence. Puis déterminez le nombre de cellules associé au CSM par rapport à la valeur d'absorbance obtenue à partir de nombres connus de cellules A SC viables. Mélangez cinq milligrammes d'un CSM chargé de SC avec du collagène de type un extrait du rat à 7,5 milligrammes par millilitre.

Tendon de la queue, ajuster le pH à 6,8 à l’aide de soude à deux normes et verser dans une plaque de culture. Insérer pour fibriller, puis transférer dans une plaque de 12 puits et incuber pendant 30 minutes. Continuer à renouveler le milieu pour les gels de collagène A-S-C-C-S-M tous les deux jours pendant la période d’incubation.

Surveiller également, libérer et observer la migration des cellules à partir des microsphères de chitosane vers le gel en utilisant des techniques de microscopie standard. Cet exemple suivant décrit la stratégie in vitro permettant de délivrer des cellules souches adipeuses à partir de microsphères de chitosane vers un support tridimensionnel en gel de collagène. Les images de MEB et de MET indiquent une préparation de microsphères de chitosane poreuses de taille uniforme.

L'incubation des microsphères avec des cellules souches mésenchymateuses primaires dérivées du tissu adipeux indique 4 000 cellules par milligramme de CSM calcium am. La coloration d'une SC montre une adhésion sur le CSM avec des filopodes s'étendant dans les interstices poreux de la microsphère. Lorsque les CSM chargées de cellules ont été mélangées avec le gel de collagène, les cellules migrent dans le gel et peuvent être suivies au fil du temps.

Les implications de cette technique s'étendent immédiatement à la thérapie des pertes tissulaires massives et chroniques. Toutefois, ce protocole thérapeutique offre un potentiel bien plus vaste en raison de sa polyvalence, permettant son association avec divers types de cellules et/ou de biomatériaux utilisés pour traiter différents degrés de pertes tissulaires, tant dans les tissus mous que dans le tissu cardiaque. Il ne fait aucun doute que cette méthode peut fournir des informations essentielles sur la livraison des cellules hôtes.

Il peut également être appliqué à d'autres systèmes, comme les produits injectables, la délivrance de médicaments thérapeutiques, ou encore la mise au point de systèmes hybrides permettant de délivrer simultanément des cellules et des médicaments thérapeutiques.