Synthèse Submonomer en phase solide de polymères et de leurs peptoïde auto-assemblage dans le hautement ordonné nanofeuillets

L'objectif général de cette procédure est de décrire une méthode simple et efficace de synthèse peptidique en phase solide et d'auto-assemblage aqueux de peptides en feuillets nanostructurés hautement ordonnés. Structurellement similaires aux polypeptides, les peptides sont des polymères de glycine substitués dont les chaînes latérales sont liées à l'azote plutôt qu'au carbone alpha. Le processus commence par la synthèse d'une séquence peptidique spécifique selon la méthode du sous-monomère.

La méthode du sous-monomère comprend deux étapes chimiques simples permettant d'insérer chaque monomère dans la chaîne de manière séquentielle. Premièrement, une amine fixée sur un support solide est bromoacétylée. Deuxièmement, le bromure est remplacé par une amine primaire.

Ces étapes sont répétées jusqu'à l'obtention de la longueur de chaîne souhaitée. Après l'allongement de la chaîne, le peptide est clivé du support solide et l'huile brute de peptide obtenue est purifiée par HPLC et caractérisée afin d'initier l'auto-assemblage des peptides en feuillets nanométriques. Une solution tampon aqueuse diluée du peptide est préparée dans un flacon en verre et mélangée délicatement. En dernière étape.

Les nano-feuillets sont examinés au microscope. Les résultats démontrent qu'un cycle itératif de deux étapes chimiques simples peut produire un polymère spécifique à la séquence qui s'auto-assemble spontanément en nano-feuillets. Les peptides constituent une classe nouvelle de polymères inspirés du vivant, dont les propriétés se situent entre celles des protéines et des polymères traditionnels.

Ils sont robustes et synthétiquement polyvalents comme les polymères traditionnels, mais sont également très ajustables et spécifiques en séquence, comme les protéines et les peptides ADN. Ces derniers émergent comme un matériau avancé permettant de résoudre des problèmes clés en biomédecine et en science des matériaux, tels que l'identification de médicaments bioactifs ou la conception de protéines artificielles. Les principaux avantages des peptides incluent un contrôle précis de la séquence, la disponibilité de blocs de construction incroyablement diversifiés, une synthèse efficace et une stabilité vis-à-vis des protéases. La méthode générale de synthèse manuelle de peptides, impliquant un équipement de base et des réactifs disponibles dans le commerce, est décrite ici, ce qui permet de synthétiser facilement des peptides dans la plupart des laboratoires.

La démonstration visuelle des étapes de synthèse est essentielle et constitue une référence précieuse pour les personnes qui s'initient au domaine de la synthèse en phase solide. Pour la première fois ici, la purification et la caractérisation d'un peptide amphiphile de 36 mers sont décrites, ainsi que son auto-assemblage en feuillets nanostructurés hautement ordonnés. Commencez ce protocole par la mise en place du dispositif expérimental, tel que décrit dans le protocole écrit.

Les étapes suivantes seront réalisées dans un récipient réactionnel en verre au lieu d'une cartouche frittée jetable en polypropylène, pour plus de clarté. Après avoir préparé 100 milligrammes de résine d'amide R dans un récipient réactionnel fritté, faire gonfler la résine en ajoutant deux millilitres de diméthylformamide ou DMF, puis agiter par barbotage pendant 10 minutes. Ensuite, éliminer la solution sous vide afin d'isoler la résine gonflée.

Ensuite, ajoutez un millilitre de 20 % de pyridine complète dans le DMF pour déprotéger le groupe FM O. Agitez pendant deux minutes et éliminez le liquide. Répétez ce processus pendant 12 minutes, puis rincez la résine en ajoutant deux millilitres de DMF, en agitant pendant 15 secondes et en éliminant le liquide.

Commencez la croissance de la chaîne peptidique avec le premier cycle de sous-monomère, qui comprend une étape de bromoacétylation et une étape de déplacement. Pour la bromoacétylation, ajoutez un millilitre d'acide bromoacétique 0,6 molaire dans le DMF et 86 microlitres de diisopropylcarbodiimide. Après agitation pendant 30 minutes, égouttez et rincez avec deux millilitres de DMF.

Ensuite, effectuez le déplacement en ajoutant un millilitre d'amine à une à deux molaire dans la méthylpyrogénone, incubez pendant 30 à 120 minutes. Après l'incubation, égouttez et rincez avec deux millilitres de DMF. Poursuivez à nouveau la croissance de la chaîne peptidique en répétant le cycle de sous-monomère. Une fois le déplacement final terminé, rincez avec deux millilitres de DMF.

Suivez par une coupelle de lavage au méthane diora et conservez le récipient à réaction jusqu’au clivage. Pour commencer le clivage, transférez toute la résine séchée dans un flacon en verre de scintillation de 20 millilitres, en travaillant sous hotte et en utilisant des équipements de protection individuelle adéquats, ajoutez quatre millilitres d’acide trifluoroacétique, ou cocktail de clivage TFA, dans le flacon en verre de scintillation et fermez-le. Agitez vigoureusement de 10 minutes à 2 heures à température ambiante.

Alternativement, utiliser un agitateur rotatif pour mélanger la solution. Recueillir la solution de clivage au TFA en filtrant la résine à travers une cartouche frittée en polypropylène jetable dans un nouveau vial en verre de scintillation de 20 millilitres préalablement pesé. Ensuite, ajouter un millilitre de nouveau mélange de clivage pour rincer la résine et récupérer tout peptide résiduel.

Répétez cette opération, rincez deux fois. Évaporez l'acide trifluoroacétique en faisant passer un courant doux d'azote ou en utilisant un évaporateur à charge biot. À l'aide d'un évaporateur rotatif, dissolvez l'huile brute dans six millilitres d'un mélange d'acétonitrile et d'eau en proportion égale.

Ensuite, congeler et lyophiliser l'échantillon. Ce processus doit être répété une fois supplémentaire après la seconde lyophilisation. Enregistrer la masse du produit brut et conserver celui-ci sous forme de poudre sèche à moins 20 degrés Celsius, en combinant une analyse HPLC moldue et/ou une LC-EM par ionisation électrospray.

La pureté du produit brut et la présence du poids moléculaire souhaité peuvent être déterminées en suivant les procédures décrites dans le texte. Le mélange peptidique brut peut ensuite être purifié par HPLC préparative en phase inverse selon la procédure écrite. Cette section décrit le protocole permettant de former des feuillets à partir d'une séquence peptidique amphiphile monomérique spécifique de 36 me.

Une fois le peptide synthétisé, purifié et lyophilisé, la poudre blanche obtenue est dissoute dans du DMSO afin d'obtenir une solution mère de deux millimolaire. Ensuite, prélevez un fichier Dr.Glass pour préparer une solution peptidique de 20 micromolaire. Commencez par ajouter 445 microlitres d'eau milli Q et 50 microlitres de tampon 10 x de formation de feuillets.

Vortexez le flacon pour mélanger. Ajoutez ensuite cinq microlitres d'une solution mère de peptide à deux millimolaires et laissez gonfler doucement. Les feuillets de la solution obtenue se forment par agitation douce de la solution aqueuse diluée de peptide.

Incliner lentement le flacon en verre bouché de la position horizontale à la position verticale. Cela entraîne un brassage doux en feuilles et donne également des feuilles. Toutefois, les feuilles ont tendance à être plus petites et à présenter moins d'arêtes rectilignes par rapport à de nombreuses feuilles de haute qualité.

Faire tourner lentement les vials en verre autour de l'axe horizontal pendant un jour à l'aide d'un agitateur rotatif ou d'un berceur personnalisé pour la coloration fluorescente de feuillets nano, ajouter un microlitre de rouge Nil à 100 micromolaire à 100 microlitres de solution de feuillets nano afin d'obtenir une concentration finale de un micromolaire de Nile. Le rouge Nil est un colorant sensible à l'environnement dont l'intensité de fluorescence augmente lorsqu'il est localisé dans des environnements hydrophobes. Ensuite, préparer une solution à 1 % d'aros dans de l'eau chaude et verser dans une boîte de Pétri en plastique.

Veillez à ce que la solution d'aros ait une épaisseur d'environ un huitième de pouce et laissez-la refroidir sans perturbation sur une surface plane. Une fois que la solution d'aros a pris, utilisez une spatule pour découper des carrés d'un centimètre sur un centimètre. Transférez ensuite les carrés découpés sur une lame de verre afin de recueillir les feuillets dans le même plan, puis déposez un microlitre de solution de feuillets sur le morceau d'aros.

Après deux minutes, les aros devraient absorber le tampon, laissant les feuillets en surface. Imager le feuillet dans les 15 minutes. Alternativement, pour imager les feuillets et charger la solution, déposer 15 microlitres à l’intérieur d’un joint de 0,12 millimètre d’épaisseur et de 20 millimètres de diamètre sur une lame de verre.

Couvrez l'échantillon avec une lame de couverture et effectuez l'imagerie en quelques jours pour réaliser la MEB des nano-feuillets. Commencez par graver au plasma les puces de silicium afin de faciliter l'adsorption des nano-feuillets. Ensuite, déposez 20 microlitres de solution de feuillets peptidiques sur un substrat de silicium traité au plasma et laissez reposer la solution pendant trois minutes. Retirez ensuite l'excès de solution à l'aide de la pointe d'un essuie-tout, ajoutez 20 microlitres d'eau sur la surface, puis retirez à nouveau l'excès de solution par capillarité afin d'éliminer le tampon et les sels.

Alternativement, les solutions de feuillets peptidiques sont dialysées contre de l'eau afin d'éliminer le tampon et le sel. Dans ce cas, 20 microlitres de la solution de feuillets dialysée peuvent être déposés sur les substrats de silicium traités au plasma et laissés sécher à l'air. Une fois la solution de feuillets sèche sur les substrats de silicium traités au plasma, les feuillets peuvent être observés en MEV à l'aide d'un détecteur intégré à l'objectif, avec des énergies de faisceau comprises entre un kilovolt et cinq kilovolts.

La synthèse, la caractérisation et la purification d'un peptide chargé en bloc de 36 mé, spécifique à la séquence et se repliant en une nano-feuille bidimensionnelle hautement ordonnée, ont été réalisées. Les amines utilisées lors de la synthèse du peptide chargé en bloc de 36 mé permettront de lier l'éthylènediamine au phényléthylamine et à la β-alanine t-butyle. Après la synthèse, le peptide brut a été clivé de la résine à l'aide de TFA aqueux à 95 %.

Après avoir collecté et évaporé la solution de TFA, le peptide brut à charge bloquée 36 me a été purifié par HPLC en phase inverse. La masse du peptide à charge bloquée purifié a ensuite été confirmée par moldy.

La masse observée de 4981,2 correspond étroitement à la masse calculée de 4981,74. La poudre lyophilisée a été dissoute dans du DMSO afin de préparer une solution mère de deux millimolaire et stockée à quatre degrés Celsius. Les lames ont été préparées selon le protocole susmentionné et observées par microscopie optique à fluorescence.

Une variété de formes aux dimensions caractéristiques allant jusqu'à 300 microns est observée, et des arêtes nettement rectilignes sont particulièrement visibles. La MEB a également été utilisée pour imager les feuillets, révélant de manière similaire des arêtes rectilignes marquées. Cette vidéo décrit un protocole simple et efficace pour la synthèse en phase solide de peptides et l'auto-assemblage aqueux de peptides en feuillets nanométriques.

Étant donné que des centaines de précurseurs d'acides aminés sont facilement disponibles et peuvent être utilisés dans ce protocole, l'espace de conception accessible avec les polypeptides est pratiquement illimité. Les peptides constituent des matériaux prometteurs pour la recherche en biomédecine et en nanoscience en raison de leur flexibilité synthétique, de leur robustesse et de leur capacité à s'organiser. À l'échelle atomique en particulier, les feuillets nanostructurés offrent une plateforme potentielle pour des échafaudages d'affichage bidimensionnels, des mimes de membranes, des capteurs biologiques, des mimes de protéines et la fabrication de dispositifs.

Travailler avec des réactifs corrosifs tels que le trio, l'acide acétique et l'acide bromoacétique est extrêmement dangereux ; afin d'éviter toute blessure, effectuez toutes les réactions sous une hotte de ventilation et portez des équipements de protection individuelle adéquats.