Pull-down des protéines se liant à la calmoduline

L'objectif général de cette procédure est de tester les protéines qui se lient à la calmoduline de manière dépendante du calcium. Cela est réalisé en premier lieu en collectant les protéines d'intérêt. Ensuite, des billes de sépharose liées à la calmoduline sont préparées pour la fixation des protéines.

Ensuite, les protéines sont incubées avec des billes de sépharose liées à la calmoduline. Enfin, les protéines qui se lient de manière dépendante du calcium sont élutées. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant les protéines qui se lient à la calmoduline en présence ou en absence de calcium, grâce à une analyse par immunotransfert.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes, telles que la chromatographie douce et la précipitation immunitaire, est qu'elle nécessite moins de protéines et moins de temps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation de la modline bovine, comme quelles protéines se lient à la modline bovine de manière dépendante du calcium, et comment les modifications post-traductionnelles peuvent influencer leur liaison à la modline bovine. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de manipulation des billes sont cruciales et la description de la reprise et de la rétention des billes est difficile à suivre sans illustration.

Pour préparer le tissu en vue d'une injection homogène dans des tranches hippocampiques organotypiques à l'aide d'un virus contenant un plasmide exprimant la protéine recombinante d'intérêt. Dans cet exemple, la protéine recombinante est Neuro Grandin marquée par la GFP. Laisser le tissu exprimer la protéine pendant la nuit, environ 12 à 18 heures après l'injection virale, puis ajouter un millilitre de tampon de dissection dans une boîte de Pétri.

Transférez le tissu cultivé avec son insert dans la boîte de Pétri et ajoutez deux millilitres de tampon de dissection dans l'insert afin d'immerger le tissu à l’aide d’un scalpel. Prélevez cinq à 10 tranches de tissu hippocampique organotypique en détachant délicatement le tissu de la membrane de l'insert à l’aide d’une pipette Pasteur inversée. Transférez le tissu en suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Ensuite, centrifuger les échantillons à 1500 RCF pendant une minute. Pour séparer le tissu du tampon de dissection, retirer soigneusement le surnageant par aspiration. Veiller à ne pas perturber le culot.

Pour chaque coupe utilisée, ajouter le tissu à 30 à 60 microlitres de tampon d'homogénéisation à l’aide d’une pipette de un millilitre à embout coupé, puis homogénéiser soigneusement à l’aide d’un pilon avant de remettre l’homogénat dans son tube d’origine. Afin d’éliminer les débris cellulaires, centrifuger l’homogénat restant à 1100 RCF pendant 10 minutes et recueillir délicatement le surnageant par aspiration en évitant toute contamination par le culot. Prélever 10 % du surnageant en aliquotes comme échantillon d’entrée.

Conserver le surnageant restant sur de la glace pendant la préparation des billes cal sero destinées à l'utilisation. Ensuite, pour chaque prélèvement, pipeter 400 microlitres de billes cal Modlin Sero en suspension dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres à fond relativement plat afin de maximiser la surface et l'interaction des solutions avec les billes pendant les incubations, faire rouler le tube de microcentrifugeuse sur le côté pour humidifier les billes, puis centrifuger les billes à 21 000 ×g pendant 30 secondes.

Et retirez soigneusement le surnageant par aspiration. Veillez à ne pas perturber les billes afin de les laver avec 100 microlitres du tampon d'homogénéisation respectif contenant soit deux millimolaires de chlorure de calcium pour les billes utilisées afin de précipiter les protéines liant la calmoduline calcique, soit deux millimolaires d'EDTA, un chélateur connu du calcium, pour les billes utilisées afin de précipiter les protéines liant l'apocalmoduline.

Tapez doucement sur le tube pour resuspendre. Suspendez les billes et centrifugez à 1500 RCF pendant une minute. Retirez soigneusement le surnageant par aspiration, en veillant à ne pas perturber les billes afin de lier les protéines à la calmoduline sphéros pour la précipitation.

Commencez par diviser le SNAT en deux volumes égaux. Selon la condition par aliquote, ajoutez la quantité appropriée de chlorure de calcium ou d'EDTA au surnageant pour obtenir une concentration finale de deux millimolaire. Ajoutez le surnageant aux billes lavées dans le tampon d'homogénéisation approprié.

Tapotez doucement le tube pour mélanger. Incubez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant trois heures sur un agitateur. Nous suspendons les billes toutes les 30 minutes environ afin d'augmenter l'efficacité de la liaison.

Centrifugez ensuite les échantillons à 1500 RC F pendant trois minutes. Retirez 50 microlitres de surnageant comme échantillon de protéine non liée et retirez soigneusement le surnageant restant par aspiration, puis jetez-le. Lavez les billes trois fois comme précédemment avec 100 microlitres du tampon d'homogénéisation approprié.

La étape la plus difficile de cette procédure consiste à élucider les protéines cibles de manière efficace. La meilleure façon de garantir le succès est d'utiliser le bon type de tube afin de minimiser la perte de billes et de remettre correctement les billes en suspension dans le tampon d'élution chauffé. Le préchauffage du tampon d'élution peut également aider de manière significative. Pour éluer la protéine, ajouter 50 microlitres de tampon d'élution aux billes.

Les échantillons homogénéisés et liés dans un tampon contenant du calcium sont dilués dans un tampon contenant de l'EDTA, et les échantillons qui contenaient un tampon à l'EDTA sont dilués avec du calcium. Incuber les billes à température ambiante pendant 30 minutes sur un agitateur. Mélanger les billes en tapotant doucement le tube toutes les cinq minutes environ.

Centrifuger les billes à 1500 RCF pendant trois minutes et retirer soigneusement les 50 microlitres de SNAT pour l'échantillon de protéine liée par aspiration. Veiller à ne pas perturber les billes. Réaliser une électrophorèse SDS-PAGE suivie d'un immunotransfert pour identifier la protéine d'intérêt comme témoin positif dans la condition opposée.

Protéine Pro connue pour se lier à la calmoduline. Cette figure montre un exemple de test d'immunoprécipitation par la calmoduline évaluant la liaison de la neurograndine marquée GFP TAG à la calmoduline par rapport à la neurograndine endogène. L'analyse de l'entrée homogène montre que la neurograndine GFP était exprimée en plus de la neurograndine endogène et de la kinase 2 dépendante de la calmoduline et du calcium, comme prévu d'après la liaison connue de la neurograndine endogène.

La protéine Neuro Grandin marquée par la GFP a été éluée en l'absence de calcium et ne s'est pas liée en présence de calcium. En revanche, la kinase deux dépendante de la calmoduline, utilisée comme témoin, a été éluée uniquement en présence de calcium et non liée en son absence. Cela montre que les billes de calmoduline fonctionnaient correctement et que les EEU étaient efficaces.

Plus important encore, cela montre que la neurogrine GFP se lie à l'apoch calmoduline d'une manière similaire à la forme endogène, ce qui suggère que la marque GFP n'a pas altéré la fonction de la protéine recombinante. Une fois maîtrisée, cette technique, sans inclure la migration SDS-PAGE ni l'analyse par immunotransfert, peut être terminée en six heures si elle est correctement réalisée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de bien étiqueter tous les échantillons et tubes selon la condition appropriée, car toute variation de la concentration en calcium peut compromettre l'ensemble de l'expérience. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer efficacement la capacité de protéines spécifiques à se lier à un module CAL de façon dépendante du calcium.

En recueillant les protéines d'intérêt, en les incubant avec les nanoparticules SRO correctement préparées agissant comme co-modulatrices, en éluant les protéines liées et en les analysant par immunotransfert.