Visualisation des vasculaire Ca ^{2 +} Signalisation Déclenchée par paracrine Dérivé ROS

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la signalisation calcique vasculaire induite par les espèces réactives de l'oxygène, ou ERO, d'origine paracrine. Cela est réalisé en visualisant d'abord les ERO à l'aide de colorants sensibles à l'oxydation dans les macrophages actifs. Les ERO peuvent également être visualisées dans les cellules endothéliales à l'aide de capteurs fluorescents basés sur des plasmides.

Ensuite, procédez à la visualisation simultanée des macrophages activés marqués au traceur cellulaire rouge et des cellules endothéliales quadruplement marquées dans un modèle de co-culture. Enfin, mesurez la signalisation calcique dans les cellules endothéliales induite par les espèces réactives de l'oxygène (ROS) dérivées des macrophages à l'aide d'un système d'imagerie confocale.

Ces résultats peuvent démontrer les niveaux de ROS indépendamment, tout en évaluant simultanément la mobilisation calcique intracellulaire induite par les ERO d'origine pérégrine. Cette méthode permet l'évaluation simultanée de deux molécules de signalisation différentes qui interagissent étroitement pour provoquer un environnement de signalisation vasculaire et un cadre physiopathologique simulateur. Deux post-doctorants de mon laboratoire, Karthik et Raj, démontreront la procédure sur les mesures de ROS et de calcium ainsi que sur les interactions entre macrophages et cellules endothéliales.

Cultiver des macrophages dérivés de monocytes de souris sur des boîtes de 35 millimètres à fond en verre. Ensuite, stimuler les cellules avec des agonistes du récepteur de type Toll et incuber pendant six heures à 37 degrés Celsius. Pour la visualisation du cytosol.

Ajouter le colorant sensible à l'oxydation et incuber les cellules pendant 20 minutes. Visualiser ensuite les cellules sur un plateau contrôlé en température d'un système d'imagerie confocale. En alternative, pour visualiser les ERO mitochondriales dans des cellules activées par les TLR, ajouter l'indicateur de superoxyde mitochondrial et incuber les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Pour un témoin négatif, traitez les cellules avec du PBS ou du DMSO pour un témoin positif. Traitez les cellules avec deux millimètres d'antimycine. Puis procédez à la visualisation de toutes les cellules sur la platine contrôlée en température d'un système d'imagerie confocale.

À l'aide du logiciel ImageJ, analyser toutes les données d'images. Le capteur fluorescent détecte de façon très spécifique des concentrations submicromolaires de peroxyde, et selon la conception du vecteur d'expression mammalienne, il peut être dirigé soit vers le cytoplasme, soit vers les mitochondries. À l'aide de l'électroporation, créer des lignées stables de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires de souris portant un plasmide d'expression inappropriée de Hyper.

Pour faciliter la croissance des colonies, ensemencez les cellules à faible densité dans du TMEM complet et incubez pendant 48 heures, puis remplacez le milieu par un milieu de culture complet supplémenté avec un antibiotique de sélection. Sélectionnez les clones présentant le pourcentage le plus élevé de cellules hyper positives et amplifiez la culture afin de créer des lignées stables hyper positives pour des expériences individuelles. Ensemencez les cellules sur des lamelles recouvertes de gélatine à 0,2 % et cultivez-les toute la nuit jusqu'à une confluence de 80 %.

Activez maintenant les cellules avec des ligands de TLR et incubez pendant six heures à 37 degrés Celsius. Pour la détection des ERO cytoplasmiques, montez les lamelles de cellules sur une chambre à cellules adelo. Ajoutez un millilitre de solution saline tamponnée préchauffée et placez la chambre sur une platine chauffée du système d'imagerie confocale.

Enregistrez les variations de fluorescence dans les cellules pour la détection du ROS mitochondrial. Incluez un contrôle positif constitué d'antimycine A à deux micromoles. Préparez ensuite les lamelles de cellules traitées pour la microscopie confocale. Effectuez l'analyse d'image à l'aide du logiciel ImageJ.

Commencez avec des cellules endothéliales cultivées jusqu'à une confluence de 80 % sur des lamelles en verre recouvertes de gélatine, afin de visualiser et mesurer les variations du calcium intracellulaire. Incubez les cellules dans le colorant fluorescent fluo-4 AM à température ambiante pendant 30 minutes. Pour minimiser la perte de colorant, lavez les cellules avec la solution d'imagerie expérimentale contenant du sulfinpyrazone. Montez ensuite les lamelles dans une chambre pour cellules adéquate contenant 800 microlitres de solution d'imagerie expérimentale préalablement réchauffée, puis placez les cellules sur un plateau chauffant régulé en température du système d'imagerie confocale dans un tube séparé.

Utilisez 500 nanogrammes par millilitre de traceur cellulaire rouge C-M-T-P-X pendant 15 minutes pour marquer la population de macrophages à l’étude, lavez les cellules et resuspendez les culots dans 200 microlitres de solution expérimentale d’imagerie. Ajoutez ensuite les macrophages marqués sur les cellules endothéliales chargées de fluoh 4:00 AM dans l’assemblage de chambre confocale. Enregistrez la fluorescence verte et rouge toutes les trois secondes pendant 10 minutes.

Dans cette expérience, les cellules J 7 74 0,1 ont été stimulées par des ligands des TLR deux, trois et quatre pendant six heures. Des images confocales représentatives montrent une augmentation du R os cytosolique mesurée par DCF. Fait intéressant, la fluorescence rouge des mitoses socks indique une augmentation similaire du R os mitochondrial.

Ces variations de fluorescence sont quantitatives. Les résultats doivent donc être normalisés et exprimés en tant que changement relatif par traitement ; le signal de l'antimycine A valide un témoin positif pour la production de ROS mitochondriaux. Cette figure montre des images des niveaux d'hydroperoxydes endothéliaux, cytosoliques et mitochondriaux dans des cellules exprimant de façon stable hyper cyto ou hyper D mito.

MP ECS stimulés avec des agonistes de TLR. La quantification de la variation de fluorescence moyenne montre une augmentation de la fluorescence hyper cyto et hyper D mito après six heures de stimulation dans un système de co-culture. Pour évaluer la signalisation des ERO par Peregrine, des macrophages mirin fraîchement isolés provenant de souris de type sauvage et de souris nulles pour GP 91 Fox ont été activés par un microgramme par millilitre de LPS pendant six heures.

Les macrophages ont été marqués en rouge avec C-M-T-P-X et ajoutés sur des flu verts quatre.Chargés. MPM ecs. Fait intéressant, les macrophages activés par le LPS, isolés de souris de type sauvage, ont déclenché une mobilisation calcique importante et rapide dans les MPM ECS par rapport aux macrophages provenant de souris nulles pour GP 91 Fox.

Lorsque l'on tente cette procédure avec LI, il est important de se rappeler que soit un téléchargement prolongé soit une exposition au laser peuvent entraîner l'auto-oxydation du DCF. Il est essentiel d'éviter le blanchiment photo-induit de l'hyper cyto et de l'hyper D mitral. Une fois maîtrisée, la mesure du RA dans les macrophages ainsi que dans les cellules endothéliales peut être réalisée en sept heures si elle est effectuée correctement.