Assay Repliement intracellulaire

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer le repliement intracellulaire des protéines dépendant des chaperonnes après un choc thermique. Utilisez un rapporteur luciférase : transfectez d'abord les cellules avec des plasmides contenant le gène rapporteur de la luciférase et la chaperonne d'intérêt. Ensuite, divisez les cellules transfectées selon les points temporels de récupération prévus dans le plan expérimental.

Le jour suivant, soumettez les cellules à un choc thermique afin d'induire le dépliage des protéines. Permettez une période de récupération pour rétablir le repliement intracellulaire des protéines, puis mesurez l'activité du rapporteur luciférase. Les résultats évaluent le repliement des protéines dépendant du temps et des chaperonnes, basé sur le dosage de la luciférase.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de repliement in vitro, réside dans la possibilité d'obtenir une lecture physiologique plus pertinente de l'effet de composés ou de protéines sur l'activité des chaperonnes. Les implications de cette technique s'étendent à des thérapies pour un large éventail de maladies telles que les maladies neurodégénératives ou le cancer, car les chaperonnes jouent un rôle important dans le développement de ces pathologies. Tout d'abord, préchauffez le milieu de culture, le PBS et la trypsine à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Lavez une culture confluente de cellules HEK 293 avec cinq millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de trypsine contenant 0,025 % d'EDTA, faites pivoter doucement la plaque pour assurer une répartition uniforme de la trypsine, puis incubez à 37 degrés Celsius. Agitez périodiquement la plaque pour vérifier le détachement des cellules.

Resuspendez maintenant les cellules dans 10 millilitres de milieu DMEM complet et transférez-les dans un tube Falcon de 50 millilitres. Ensuite, dénombrez les cellules à l’aide d’un compteur Beckman. Incubez les cellules à une confluence d’environ 60 à 70 % pendant six à huit heures.

Équilibrez le réactif Extreme Gene neuf à température ambiante et l'aliquot de milieu sans sérum à 37 degrés Celsius. Pipetez le milieu sans sérum dans deux tubes Eppendorf. Ajoutez ensuite le réactif Extreme Gene neuf sans toucher la paroi du tube Eppendorf et incubez pendant cinq minutes à température ambiante.

Entre-temps, préparez les mélanges de transfection ADN 2D dans le tube un, ajoutez le luciférase ran vanilla et un contrôle de vecteur vide dans le tube deux. Ajoutez la luciférase ran vanilla et la chaperonne moléculaire. Ajoutez l'ADN au mélange de réactif de transfection, vortexez et incubez à température ambiante pendant 20 minutes.

Continuer à ajouter ce mélange sur les cellules en culture et incuber pendant 24 heures. Récolter les cellules transfectées à l’aide de trypsine, ensemencer les cellules à une confluence de 60 à 70 % dans des plaques à six puits et les laisser toute la nuit dans l’incubateur. Aspirer le milieu des cellules transfectées.

Ensuite, ajouter un millilitre de tampon de choc thermique et incuber pendant 30 minutes. Pour arrêter la synthèse de novo des protéines, sceller les couvercles avec des bandes de paraforme et incuber dans un bain-marie à 45 degrés Celsius pendant 30 minutes. Retirer maintenant le paraforme et replacer les cellules dans l'incubateur pour une récupération aux points temporels spécifiés.

Récupérez les cellules et lavez-les une fois dans du PBS. Pour une lyse cellulaire efficace, congélez rapidement le culot cellulaire dans de l'azote liquide, puis ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse passif dilué. Répartissez maintenant en triplicat. Ajoutez 30 microlitres du lysat cellulaire par puits d'une plaque de 96 puits.

Afin d'évaluer l'efficacité de la transfection, commencez par les échantillons de référence non choqués. Pour mesurer l'activité de la luciférase ran, préparez un tampon de réaction frais contenant 0,2 millimolaire de Lucifer dans un tampon gly Gly, 1 millimolaire de A TP et 0,2 micromolaire de tampon de réaction ezine. Insérez la plaque 96 puits dans le luminomètre et démarrez le programme.

Poste de travail Wallach 1420. Introduisez la pompe n°1 dans le tube Falcon contenant le tampon de réaction à l'ézine à 0,2 micromolaire. Dans le menu, sélectionnez l'option d'entretien du distributeur, puis cochez la pompe n°1.

Sélectionnez l'option « fill » pour modifier la disposition de la plaque. Choisissez l'option « explore protocol and results » dans le menu. Sélectionnez le protocole.

Sélectionnez maintenant les puits à lire. Revenez au gestionnaire Wallach et cliquez sur démarrer pour mesurer les émissions des échantillons. À 482 nanomètres, procédez à l'entretien du distributeur et sélectionnez « vider » et « pomper un » pour renvoyer toute la solution résiduelle dans le tube.

Maintenant, déplacez le tube dans un falcon contenant de l'eau et cochez, rincez. Poursuivez en sélectionnant vide. Ensuite, placez le tube de la pompe un dans le tampon de réaction et le tube de la pompe deux dans la solution de LUCIFÉRINE.

Modifier la disposition de la plaque. Sélectionner le remplissage pour la pompe un et la pompe deux. À partir du menu de maintenance du distributeur, sélectionner le protocole et commencer à mesurer la longueur d'onde de réaction de la luciférase de luciole à 560 nanomètres.

À la fin de la répétition, répétez la procédure : videz, rincez, videz. Pour la pompe un et la pompe deux, visualisez les résultats sur le Wallach 1420 Explorer. Chaque expérience est associée à un test.

Nombre d'utilisateurs, dates de début et de fin, exporter les résultats sous forme de fichier Excel. Pour l'analyse, le repliement des protéines est directement lié à la durée de récupération. Dans cette expérience, les cellules sont évaluées à différents moments après le choc thermique.

En l'absence et en présence d'une chaperonne moléculaire. Comme prévu, le pourcentage de luciférase repliée augmente avec une durée de récupération prolongée, tant dans les témoins que dans les cellules transfectées avec la chaperonne moléculaire. En revanche, un jeu de données non valide présente de faibles valeurs de R carré pour la corrélation entre le temps et le repliement.

Après avoir appliqué cette technique, d'autres méthodes, telles que le test in vitro de l'activité de repliement assisté par chaperon (TPAs), peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'inhibition de l'activité enzymatique de la chaperonne. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer les protéines intracellulaires. Nous suivons les événements après le choc thermique.