Surveillance des protéines par adsorption à semi-conducteurs Nanopores

L'objectif général de cette procédure est de créer des nanopores dans des membranes artificielles afin de les utiliser dans des études d'absorption des protéines. Cela est réalisé en perforant des nanopores dans une membrane de nitrure à l'aide d'un microscope électronique en transmission (STEM). Ensuite, le nanopore est inséré dans une chambre et humidifié avec une solution ionique.

Ainsi, le liquide forme un pont d'un côté du nanopore à l'autre, préparant le nanopore pour les expériences. Une tension est appliquée à travers celui-ci et un courant d'ions peut être observé en train de le traverser. La dernière étape consiste à ajouter la protéine dans la chambre du nanopore.

L'observation finale de blocages de longue durée dans le courant ionique traversant le nanopore révèle l'absorption de protéines sur les parois du nanopore. Bonjour, je suis Dave Wicki. Je suis étudiant diplômant au Département de physique de l'Université de Syracuse.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'absorption de protéines sur des surfaces inorganiques, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les interactions protéine-acide nucléique, la spectroscopie de molécules uniques et l'étude de molécules dans des espaces confinés. Commencez par amener le microscope électronique en transmission à une tension d'accélération.

Ensuite, insérez une grille à fenêtre en nitrure de silicium SPI dans le porte-échantillon de MET. Nettoyez la grille avec un plasma d'oxygène pendant 30 secondes afin d'éliminer les débris. Avant de charger l'échantillon, insérez le porte-échantillon dans la MET et laissez le vide s'établir.

En utilisant le mode TEM en champ clair, repérez la fenêtre de nitrure, un carré brillant sur le programme brut. Assurez-vous que le MET est correctement aligné. Ensuite, alignez et focalisez l'échantillon.

Placez maintenant le système en mode STEM et utilisez un détecteur hors axe pour imager l'échantillon et vérifier son alignement. Réglez le monochromateur, s'il est présent, sur une valeur faible, afin d'obtenir un courant d'électrons plus élevé pour le perçage. Sélectionnez la taille de spot appropriée pour forer le nanopore en fonction du diamètre du faisceau d'électrons.

Avec le stade aligné. Utilisez le BROGRAM pour focaliser parfaitement sur la membrane de nitrure à l'agrandissement requis. S'il y a un mouvement quelconque de l'échantillon, balaiez le faisceau d'électrons et attendez que l'échantillon se stabilise.

Cela peut prendre jusqu'à une heure. Une fois stabilisé, placez la sonde électronique sur l'échantillon et commencez le perçage du nanopore. Le perçage d'un nanopore à l'aide d'un microscope électronique en transmission (TEM) exige une grande patience.

Il s'agit d'un processus au cours duquel le nitrure est progressivement dissipé sous une sonde à faisceau d'électrons. Il est important de maintenir la sonde électronique directement au-dessus du site de perçage et de confirmer que le nanopore est entièrement percé. Avant de retirer l'échantillon du MET, vérifiez périodiquement l'échantillon en effectuant une analyse avec le détecteur activé.

Si l'échantillon dérive légèrement, ajustez la position de la sonde électronique afin qu'elle se trouve au-dessus du nanopore. Lorsque le gramme de la zone d'intérêt est en netteté, le film de nitrure scintillant disparaîtra. Lorsque le nanopore se forme avec le gramme roky hors netteté, la frange de bord effilochée est visible.

Imager le nanopore avec le faisceau électronique éteint et établir un profil d'intensité de l'image. Le diamètre du nanopore peut être estimé à partir de la région la plus sombre du profil. La sonde électronique peut être utilisée pour agrandir le nanopore si nécessaire.

Une fois le diamètre requis atteint. Passez en mode MET avec le monochromateur en réglage standard. Utilisez la microscopie électronique en transmission en champ clair pour confirmer la taille des pores.

Commencez par préparer la solution saline désaérée. Placez la solution sous vide et soumettez-la à une sonication en bain pendant 20 minutes. Placez délicatement la puce en nitrure de silicium contenant le nanopore dans un bécher Pyrex de 10 millilitres. Ensuite, dans une hotte, placez le bécher sur un chauffe-plaque.

Nettoyez très soigneusement la puce Nanopore avec la solution de piranha. Ajoutez d'abord trois millilitres d'acide sulfurique dans le récipient à l'aide d'une pipette en verre. Ensuite, ajoutez prudemment un millilitre de peroxyde d'hydrogène concentré à l'acide sulfurique.

Veuillez prendre toutes les précautions. Laissez le chip à nanopores tremper pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre, retirez la solution piranha du bécher et éliminez-la correctement.

Ensuite, remplissez le bécher avec de l'eau déionisée désaérée. À l'aide d'une pipette en verre propre, videz le bécher d'eau et répétez ce rinçage au moins cinq fois. À l'aide de pinces propres, retirez la puce à nanopores et séchez-la par aspiration légère.

Une fois sec, scellez immédiatement la puce à nanopores dans la chambre. La puce peut être fixée dans la chambre à l'aide de joints toriques ou d'un scellant en silicone. Remplissez la chambre avec une solution de chlorure de potassium.

Connectez les électrodes en argent, chlorure d'argent à la chambre. Les électrodes peuvent être fabriquées en trempant un fil d'argent dans de l'eau de Javel toute une nuit. Appliquez un potentiel transmembranaire entre les électrodes et surveillez la réponse en courant à l'aide d'un amplificateur de patch-clamp.

En mode blocage de tension, construisez une courbe courant-tension à partir des mesures. La courbe doit être fortement linéaire. Lorsque l'on utilise du chlorure de potassium à une molaire, la conductance du nanopore doit correspondre à son diamètre.

Si le nanopore n'affiche pas une courbe courant-tension linéaire, la conductance est trop faible ou le courant d'ouverture du nanopore n'est pas stable. Cela indique que le nanopore n'est pas correctement intégré et que le lavage piha doit être répété. Il est essentiel de s'assurer qu'un liquide se trouve à l'intérieur du nanopore.

Si cette étape n'est pas effectuée correctement, le courant ionique à travers le nanopore présentera un bruit très important et le piégeage des protéines dans le nanopore sera fortement réduit. Commencez par ajouter un échantillon purifié de la protéine d'intérêt dans la chambre reliée à la masse. Attendez que l'échantillon diffuse complètement.

Appliquez une tension de polarisation transmembranaire dont la polarité est opposée à celle de la charge totale de la protéine étudiée. Une tension appliquée de 200 millivolts devrait être suffisamment élevée pour être observée. La plupart des événements liés aux analytes protéiques apparaîtront sous forme de déviations transitoires du courant par rapport à la ligne de base.

Si aucun signal n'est observé, augmentez la concentration de la protéine dans la chambre. Des tensions plus élevées améliorent le rapport signal sur bruit et le nitrure. Les nanopores peuvent supporter plusieurs volts.

Les absorptions protéiques apparaîtront sous forme de modifications durables du courant de base du nanopore. Les résultats typiques pour les nanopores à l'état solide seront les suivants. Le courant du pore ouvert doit être très stable.

Les caractéristiques courant-tension (IV) du nanopore doivent être très linéaires. Dans une solution de chlorure de potassium à une molaire et de phosphate de potassium à dix molaires, pH 7,4, la pente d’un ajustement linéaire de la courbe IV fournit la conductance unitaire du nanopore. La conductance est directement liée au diamètre du nanopore et doit correspondre à l’équation.

Cette valeur devrait correspondre à une marge de 30 %. Si la valeur est trop faible, il est probable que le pore ne soit pas associé à l'ajout de protéine. Des événements rapides devraient suivre ; l'absorption de protéine correspond à une chute durable du courant. Certaines protéines sont très labiles et subissent une transformation structurale à l'intérieur du pore.

Dans ce cas, la chute de tension à longue durée sera accompagnée de fluctuations rapides. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer des nanopores à l'état solide à l'aide d'un microscope électronique en transmission balayage, et comment utiliser ces pores pour l'absorption de protéines SA. N'oubliez pas que le travail avec la solution piranha peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que travailler sous une hotte aspirante avec des gants, une blouse de laboratoire et un tablier chimique, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.