Application de la MassSQUIRM pour des mesures quantitatives de l'activité Déméthylase Lysine

Le protocole mass squirm vise à quantifier l'activité de la lysine déméthylase en utilisant la méthylation isotopique et la spectrométrie de masse MALDI. Commencez par réaliser des réactions de déméthylation catalysées par des enzymes sur des peptides contenant de la lysine méthylée. Ensuite, méthylez chimiquement les produits peptidiques de la réaction de déméthylase avec du formaldéhyde deutéré afin d'obtenir des peptides uniformément méthylés qui s'ionisent de la même manière par MALDI. Puis, quantifiez chaque espèce peptidique par spectrométrie de masse en mode multiple et tenez compte du recouvrement isotopique. Afin d'identifier les quantités relatives de peptides non, mono, di et triméthylés, les résultats du mass squirm déterminent les quantités relatives de chaque produit de la réaction de déméthylase en fonction des variations de masse.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la spectrométrie de masse classique sur moisissures, réside dans le fait que le score de masse tient compte des différences d'ionisation entre les peptides différemment méthylés. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette approche lorsque nous avons mis au point une méthode permettant de mesurer les niveaux d'acétylation des histones à l'aide d'anhydride acétique isotopiquement lourd. La difficulté de cette technique réside dans l'extraction des données de surface des pics, qui peut être compliquée par le recouvrement des enveloppes isotopiques des peptides.

Pour la réaction de déméthylation, combiner 125 nanogrammes d'enzyme recombinante déshydrogénase spécifique de la lysine une avec 0,25 microgramme de peptide d'histone H3 diméthylé biotinylé dans un volume final de 20 microlitres de tampon déméthylase. Préparer également un échantillon témoin contenant 0,25 microgramme de peptide sans l'enzyme LSD1, puis incuber les tubes de réaction et les tubes témoins pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, pour préparer R2 des billes poreuses de 20 microns, mélanger des volumes égaux de billes et de méthanol.

Ensuite, ajouter 10 volumes d'acide trifluoroacétique (TFA), ajouter huit microlitres de billes poreuses à chaque échantillon et agiter pendant 15 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, conditionner deux embouts C18. Effectuer deux pipetages avec 20 microlitres de TFA à 0,1 %, quatre fois avec 70 % d'acétonitrile contenant 0,1 % de TFA, puis à nouveau quatre fois avec du TFA à 0,1 %.

Ensuite, chargez les deux échantillons sur les embouts zip préparés. À l’aide d’une pipette, faites passer le volume à travers la résine C 18. Répétez jusqu’à ce que le volume total des deux échantillons ait traversé les embouts zip.

Ensuite, lavez les embouts zip deux fois avec 20 microlitres de TFA à 0,1 %, éluerez les échantillons dans 40 microlitres de tampon illusion, puis séchez complètement au moyen d'un concentrateur sous vide rapide. Resuspendez d'abord l'échantillon dans 100 microlitres de tampon phosphate 50 millimolaire, pH 7,4. Ajoutez ensuite huit microlitres de diméthylamine borée et 16 microlitres de formaldéhyde désactivé.

Incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Répéter la méthylation réductrice en ajoutant de la diméthylamine banale et du formaldéhyde deutéré, puis incuber pendant deux heures. La troisième fois, ajouter de la diméthylamine banale et incuber à quatre degrés Celsius pendant 15 heures.

Arrêtez la réaction avec 12,5 microlitres de tris un molaire, pH 7,4, puis séchez complètement l'échantillon à l'aide d'un concentrateur sous vide accéléré. En premier lieu, resuspendez les échantillons des réactions témoin et de déméthylation dans 100 microlitres de tampon phosphate 50 millimolaire, pH 7,4.

Ajoutez maintenant huit microlitres de billes poreuses aux échantillons de contrôle et aux réactions de déméthylase, puis récupérez-les sur des pointes Zip comme indiqué précédemment. Éluerez en volumes de deux microlitres sur une plaque d'échantillonnage MALDI et laissez sécher à température ambiante jusqu'à cristallisation. Passez ensuite à l'analyse des échantillons par spectrométrie de masse.

Ouvrez les fichiers spectro dans le logiciel de travail et exportez-les vers le logiciel M sur Z. Vérifiez ensuite les produits de réaction par spectrométrie de masse en tandem. Déterminez d'abord le rapport des aires des pics des isotopes carbone 13 C deux et carbone 13 C quatre par rapport au pic mono-isotopique pour l'échantillon témoin.

Utilisez ces rapports calculés pour quantifier la quantité relative de peptide existant dans chaque modification. État de l'échantillon de réaction de la déméthylase. L'enzyme LSD1 peut être utilisée efficacement dans la quantification par spectrométrie de masse de la déméthylation de la lysine.

Étant donné que la réaction témoin ne subit pas de méthylation réductrice, elle indique l'enveloppe isotopique typique pour ce peptide. Les aires des pics obtenus permettent de déterminer les rapports de fond du peptide existant sous les formes carbone 13 C deux et carbone 13 C quatre. Les états isotopiques, ainsi que les aires des pics du spectre de masse de la réaction témoin, permettent de quantifier la quantité relative de peptide présente dans chaque état de modification. Dans la réaction de déméthylase, les aires des pics provenant des réactions témoin et de déméthylase indiquent 33,7 % de lysine 4 diméthylée, 42,0 % de lysine 4 monométhylée et 24 % de lysine 4 non méthylée.

Cette approche par squam en masse offre des aperçus essentiels dans le domaine de l'épigénétique des histones, notamment sur la manière dont la déméthylation des résidus de lysine des histones contribue à diverses maladies. Bien que ce dosage de la méthylation ait été appliqué à l'étude des déméthylases, il peut également être utilisé pour étudier les méthyltransférases.