Quantitative, en temps réel Analyse de l'activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer en temps réel les taux de réparation de l'ADN et d'extraction nucléaire cellulaire à l'aide de balises moléculaires qui deviennent fluorescentes une fois réparées. Les balises moléculaires de réparation par excision basique sont constituées d'oligonucléotides désoxyribo contenant une structure en épingle à cheveux avec une lésion d'une seule base, six groupements fluorés oxyfluorescéine liés aux extrémités 5' et un groupement dil moti lié à l'extrémité 3'. Lorsque la structure est repliée, le groupement six fam moty est inhibé par le dab sil de manière non fluorescente par transfert d'énergie de résonance de type Förster.

Pour évaluer l'activité de réparation de l'ADN, les balises sont incubées avec des extraits nucléaires cellulaires, qui contiennent des enzymes de réparation. L'ADN glycosylase reconnaît et élimine la lésion de l'ADN présente dans la balise. Les sites ABA résultants sont des substrats pour l'endonucléase AP un ou ape un. Après reconnaissance, APE un clive l'arrière-plan de l'ADN au niveau du site ABA, permettant à l'ADN contenant le six fam de se dissocier librement de l'épingle à cheveux.

La dissociation du réactif d'extinction entraîne une augmentation de la fluorescence proportionnelle au niveau de réparation de l'ADN, ce qui peut être évalué en temps réel à l'aide d'une machine de PCR quantitative en temps réel. La capacité à réparer les lésions de l'ADN est essentielle pour chaque cellule et chaque organisme. Parmi la multitude de voies cellulaires de réparation de l'ADN, la réparation par excision de bases cible les bases endommagées pouvant résulter d'agressions oxydatives ou chimiques ; élucider le rôle d'éléments cellulaires individuels susceptibles d'influencer cette réparation constitue l'un des principaux objectifs de nos études en laboratoire.

Par conséquent, la mesure précise et sensible de l'activité de réparation de l'ADN est devenue un sujet d'intérêt dans notre laboratoire. Ce test peut fournir de telles données. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le marquage au 32PN et l'analyse par électrophorèse sur gel, est que notre technique n'utilise pas de substrats radioactifs, permet de mesurer les taux de réparation en temps réel et possède une plage dynamique très étendue.

En outre, cette approche peut utiliser plusieurs fluorochromes différents et/ou des lésions de base pour déterminer la spécificité du substrat. Nous avons montré que ce test est hautement quantitatif et très sensible dans divers contextes. Ce test d'aptamer moléculaire de réparation par excision de base permet une analyse cinétique.

La haute sensibilité et spécificité du test permettent une quantification précise de la réparation par excision de base, et il est donc utile pour les criblages d'inhibiteurs de réparation ou pour la validation. En outre, il peut être adapté pour mesurer l'activité de réparation dans des tissus et des lysats de cellules tumorales, afin d'obtenir des mesures fonctionnelles de biomarqueurs. Lors de la conception de sondes moléculaires destinées à être utilisées dans ce test, envisagez les oligonucléotides d'ADN suivants, qui ont une longueur de 43 bases, comme indiqué ici.

Travailler correctement. La séquence d'ADN n'est pas unique, mais doit permettre la formation d'une structure en épingle à cheveux. Lorsqu'elle est pliée comme illustré ici, la spécificité est obtenue par l'insertion de lésions de bases spécifiques telles que l'uracile ou le tétrahydrofuranne.

À la position X, située à six bases de l'extrémité cinq prime, la teneur en GC doit être d'au moins 32 % et une base GB ne doit pas être placée à l'extrémité cinq prime. Un marqueur six-carboxyfluorescéine ou six-FAM doit être conjugué à l'extrémité cinq prime, tandis que l'extrémité trois prime doit être modifiée par le DABSYL. Ce substrat permettra la fixation et l'activité des protéines de réparation de l'ADN, assurant ainsi l'action des glycosylases.

La position de la lésion a été choisie de manière à assurer un espace suffisant par rapport à la structure en épingle à cheveux et à l'extrémité de l'ADN. La longueur de la tige ou du duplex en épingle à cheveux doit être d'au moins 15 paires de bases. La longueur recommandée pour la boucle est de 13 bases.

La balise moléculaire témoin doit être identique à la balise moléculaire expérimentale, sauf qu'elle ne contient pas de lésion de l'ADN. Elle ne devrait donc pas être reconnue par les enzymes de réparation de l'ADN. Une fois les balises moléculaires obtenues, une évaluation de qualité doit être effectuée afin de s'assurer que les balises ne présentent pas de fluorescence avant chauffage.

Et pour déterminer la température de fusion optimale, toutes les étapes de la procédure d'extraction doivent être effectuées sur de la glace ou à quatre degrés Celsius. Pour garantir la stabilité des protéines, préparez l'expérience en refroidissant par avance deux béchers d'un litre par échantillon, du tampon de dialyse, des chambres de dialyse, une microcentrifugeuse, des tubes, des seringues et des aiguilles.

Étiquetez des tubes coniques de 15 millilitres et placez-les sur de la glace. Aspirez le milieu de croissance des cellules, puis lavez-les deux fois avec 7,5 millilitres de PBS froid après le deuxième lavage. Ajoutez cinq millilitres de PBS froid dans chaque boîte et utilisez un grattoir à cellules pour détacher les cellules de la plaque.

Transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres refroidi, puis centrifugez à 500 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après la centrifugation, retirez le surnageant et estimez le volume cellulaire compacté en le comparant à des volumes connus de liquide dans des tubes similaires. Centrifugez les tubes une minute supplémentaire, puis retirez le PBS restant à l’aide d’une pipette.

Suspendre le culot cellulaire dans 150 microlitres de réactif d'extraction nuke buster un pour chaque 50 microlitres de volume cellulaire compacté. Ensuite, transférer les cellules resuspendues dans un tube de 1,5 millilitre prérefroidi et vortexer pendant 15 secondes à vitesse élevée. Après vortexage, incuber le tube sur de la glace pendant cinq minutes, puis vortexer pendant encore 15 secondes et centrifuger à 13 000 ×g pendant cinq minutes à 4 °C.

Après la centrifugation, retirez et jetez le surnageant, qui contient la fraction cytoplasmique. Resuspendez le culot dans un mélange composé d'un microlitre de cocktail d'inhibiteurs de protéases 100 x, d'un microlitre de DTT à 100 millimolaire et de 75 microlitres de réactif d'extraction Nuke Buster, pour deux microlitres de réactif par 50 microlitres de volume cellulaire compacté.

Vortexez les cellules pendant 15 secondes à vitesse élevée. Incubez sur de la glace pendant cinq minutes, puis vortexez à nouveau pendant 15 secondes à vitesse élevée et centrifugez à 13 000 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, utilisez une seringue pour transférer le surnageant, qui contient les protéines nucléaires, vers une cassette de dialyse glissante avec une coupure de poids moléculaire de 7 000.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de DTT un molaire à 500 millilitres de tampon de dialyse prérefroidi et dialysez le lysat pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius avec un léger agitation. Après 90 minutes, transférez la cassette de dialyse dans un deuxième bécher contenant 0,5 litre de tampon de dialyse prérefroidi avec du DTT et poursuivez la dialyse du lysat pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius avec un léger agitation. À l’issue de la dialyse, l’extrait peut avoir cristallisé en raison de concentrations élevées en protéines.

Ensuite, insérez une nouvelle seringue dans un port différent de celui utilisé pour injecter la cassette et récupérez la solution de protéines nucléaires dialysée à partir de la cassette de dialyse. Essayez d'inclure les cristaux ayant un aspect trouble lors du prélèvement de la solution de protéines nucléaires dialysée. Répartissez l'échantillon en aliquotes de 20 microlitres chacune dans des tubes de microcentrifugeuse, congélez rapidement sur de la glace sèche, puis stockez à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation.

Déterminez la concentration en protéines et effectuez le contrôle qualité comme décrit dans le document accompagnant. Pour réaliser le test par balise moléculaire, décongelez et diluez les lysats cellulaires à deux microgrammes par microlitre de protéine à l’aide d’un tampon de réaction de réparation par excision basique contenant un millimolaire de DTT ; diluez les balises moléculaires à 200 micromolaires avec le tampon de réaction de réparation par excision basique. Étant donné que la machine de PCR quantitative en temps réel n’est généralement pas utilisée comme fluorimètre, modifiez la méthode d’exécution sur la machine de PCR quantitative en temps réel afin de recueillir des données toutes les 20 secondes à 37 degrés Celsius pendant au moins 180 cycles.

Ensuite, toutes les 20 secondes pendant 15 cycles, mesurez la fluorescence maximale du balise moléculaire afin d'obtenir des données pour la normalisation. Réglez le volume de réaction à 25 microlitres. Puis configurez la conception de la plaque sur l'appareil à l'aide du logiciel Applied Biosystems, en sélectionnant la courbe standard comme type d'expérience, et complétez l'agencement de la plaque.

Un exemple est présenté dans ce tableau, qui peut également être trouvé dans le document accompagnant. N'ajoutez rien au puits sélectionné comme courbe standard. Placez le tampon de réaction de réparation par excision basique, le DTT, le lysat cellulaire à une concentration de deux microgrammes par microlitre et toutes les balises moléculaires utilisées dans l'expérience sur de la glace.

Ensuite, ajoutez le DTT au tampon de réaction de réparation par excision basique pour obtenir une concentration finale de un millimolaire. Pipetez 15 microlitres de tampon de réaction de réparation par excision basique contenant le DTT dans chaque puits d'une plaque optique Q-R-T-P-C-R compatible placée sur de la glace. Puis, en suivant le schéma de la plaque, pipetez les sondes dans les puits appropriés.

Chaque combinaison de lysat et de balise moléculaire ou de contrôle doit être analysée en triple. Enfin, pipeter cinq microlitres par puits du lysat nucléaire dilué dans les puits appropriés. Il est important de garder tous les réactifs de la balise moléculaire au froid et de pipeter les lysats dans la plaque lors de la dernière étape.

N'oubliez pas que les lysats contiennent des protéines actives qui commenceront à réparer les sondes moléculaires dès qu'elles seront pipetées dans le mélange réactionnel. Par conséquent, il est très important de maintenir tous les réactifs au froid afin de minimiser la réparation des sondes avant le début des mesures. Une fois que tous les composants ont été ajoutés, scellez la plaque avec un film adhésif optique et mélangez en tapotant doucement la plaque.

Ensuite, effectuez une courte centrifugation de dix secondes à l’aide d’une centrifugeuse afin de rassembler les solutions au fond des tubes ou de la plaque après la centrifugation. Insérez la plaque dans le thermocycleur pour PCR en temps réel quantitative et démarrez le test. Une fois l’analyse terminée, exportez les données brutes, de préférence au format Excel, puis suivez les instructions fournies dans le document accompagnant pour analyser les données après avoir effectué les calculs nécessaires. Représentez graphiquement les données de fluorescence normalisées en pourcentage de FAM libre en fonction du temps en secondes, sous forme de nuage de points incluant les erreurs correspondantes, afin d’évaluer l’activité de réparation de l’ADN et la qualité des extraits nucléaires provenant des cellules LN 4 28 et d’une lignée cellulaire surexprimant MPG, désignée LN 4 28 MPG. Le test décrit dans cette vidéo a été réalisé à l’aide d’un balise moléculaire contenant le substrat APE1 tétrafurine, utilisé comme témoin positif.

Comme le montre cette figure, les deux lignées cellulaires présentent une activité APE1 robuste, indiquée par la pente prononcée, ainsi qu'une activité d'ADN glycosylase spécifique pour l'élimination du substrat MPG. L'hypoxanthine (indiquée comme HX) a été mesurée dans des lysats nucléaires provenant des deux lignées cellulaires. Chaque lysat a été analysé à l'aide d'une balise moléculaire contrôle de la réparation par excision de base ou d'une balise moléculaire de réparation par excision de base spécifique à l'hypoxanthine. Pour la balise contrôle, LN 4 28 est représenté en vert et LN 4 28 MPG en violet pour la balise hypoxanthine.

Le LN 4 28 est représenté en bleu et le LN 4 28 MPG en orange. Les résultats sont exprimés en A, unités de fluorescence moyenne et en B, fluorescence normalisée. Une augmentation dépendante du temps de la fluorescence, indicative d'une réparation de l'HX, s'est produite dans chaque cellule.

Lysat incubé avec la balise moléculaire HX comme prévu. La lignée cellulaire LN 4 28 MPG indiquée par la courbe orange présentait un taux de réparation nettement plus élevé, comme en témoigne l'accumulation plus rapide de la fluorescence, par rapport à la lignée cellulaire parentale LN 4 28, qui possède une quantité minimale de protéine MPG. Ainsi, le taux de réparation de lésions spécifiques de l'ADN par des protéines de réparation spécifiques peut être mesuré en temps réel à partir d'extraits cellulaires, avec des niveaux de fond minimes de clivage non spécifique de l'ADN.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment concevoir vos sondes moléculaires et mesurer en temps réel les taux de réparation de l'ADN à l'aide de protéines purifiées ou de lysats cellulaires. En ce qui concerne l'analyse, il est essentiel d'évaluer la gamme dynamique et les valeurs de fond ; pour ce faire, incluez des réactions témoins, par exemple avec ou sans les sondes témoins positives et négatives. Compte tenu de la variabilité entre puits, il est utile de normaliser les données des puits individuels par rapport aux valeurs initiales.

Elles sont déterminées par l'étape plus fine de la température de fusion. Ceci, ainsi que l'inclusion d'autres colorants comme un colorant « rock », permet de prendre en compte la variabilité inhérente aux erreurs de pipetage ou aux différences entre détecteurs. Cette technique nous a permis d'élucider l'influence des composants individuels de la réparation par excision sur l'activité et la capacité de réparation globales.

Il est suffisamment sensible pour révéler de légers changements qui n'auraient pas été détectables avec des méthodes conventionnelles.