Méthodes pour l'étude de la morphogenèse neuronale:

L'objectif général de l'expérience suivante est de réaliser une évaluation rapide de la fonction des gènes dans le développement du cortex cérébral à l'aide de tranches organotypiques. Cela est réalisé en introduisant des plasmides, coex, exprimant un ARN inhibiteur et un marqueur GFP dans le cortex cérébral murin. De brèves impulsions électriques sont appliquées au cerveau, permettant à l'ADN plasmidique de transfecter les cellules progénitrices neuronales.

Ensuite, les cerveaux sont disséqués, inclus et sectionnés afin de produire des tranches organotypiques capables de subir une morphogenèse neuronale ex vivo. Les tranches organotypiques peuvent être analysées pour détecter des sous-populations de neurones corticaux présentant des défauts migratoires ou morphologiques, en observant directement les cellules marquées par la GFP. Bonjour, bienvenue dans mon laboratoire de l'Université Brown, au sein du département de biologie moléculaire. Aujourd'hui, le Dr. Liza et deux étudiants, Kat Zer et Mark Seba, vont démontrer la technique d'électroporation ex vivo et la culture de tranches organotypiques, une méthode très utile pour les études en neurodéveloppement.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans divers aspects du développement neuronal, notamment la neurogenèse, la migration neuronale et la morphogenèse neuronale. Comme cette analyse est réalisée dans une approximation proche de l'environnement IBU, elle constitue une alternative peu coûteuse et rapide à la génération d'animaux transgéniques ou knock-out pour des gènes dont la fonction est inconnue. Enfin, par comparaison avec la technologie d'électroporation in vivo, la réussite de ces expériences d'électroporation in vivo ne dépend pas d'une chirurgie habile, ni d'un long apprentissage, et peut être réalisée avec un temps de formation plus court et une moindre expertise.

Après avoir euthanasié une souris femelle gravide, disséquer les embryons dans du HBSS complet glacé, en les maintenant dans leurs poches placentaires individuelles. Ensuite, dans la solution froide de HBSS, libérer un embryon de sa poche et lui couper la tête après la première vertèbre pour une injection ; placer la tête sur un morceau de papier paraforme posé sur une boîte de Pétri à l’aide d’une seringue Hamilton sur mesure. Injecter six à huit microlitres de mélange d’ADN coloré au vert rapide par le biais du troisième ventricule.

À partir de là, le mélange remplit les deux ventricules latéraux des vésicules corticales. Pour l'électroporation, des électrodes en platine en forme de pince de BTX sont utilisées. Placer l'électrode positive du côté du cortex qui sera électroporé.

Par exemple, l'électrode doit être placée au sommet du crâne pour le cortex dorsal. Pour une efficacité de transfection élevée, ajustez toujours la concentration d'ADN à un microgramme par microlitre et utilisez de l'ADN isolé à partir d'une préparation Maxi. Si nécessaire, utilisez un kit sans endotoxine pour purifier l'ADN après l'électroporation.

Incuber la tête sur de la glace pendant au moins cinq minutes avant de la disséquer. Il est très important d'utiliser la bonne quantité d'impulsions électriques et de courant lors de l'électroporation afin d'éviter d'endommager les cerveaux embryonnaires plus jeunes. Après l'électroporation, le tissu devient très fragile.

Il est important de réaliser les dissections très soigneusement, car la peau et le crâne peuvent tirer sur les méninges des vésicules corticales, ce qui pourrait endommager les vésicules corticales lors de leur retrait du crâne. Après cinq minutes, disséquer le cerveau à froid. HBSS commencez par pratiquer une petite incision sur le côté de la tête et retirez la peau des côtés de la tête.

Ensuite, à l’aide de fines pinces, détacher délicatement la pie-mère du cerveau. Retirer le cerveau intact du crâne. Une fois terminé, conserver le cerveau dans du HBSS glacé et préparer l’encapsulation du tissu.

Commencez à remplir les moules avec 3 % de point de fusion bas Agros. Placez les moules sur de la glace afin que l'Agros se solidifie près du fond du moule. Premièrement, assurez-vous que les cerveaux restent soutenus et centrés.

Maintenant, à l’aide de pinces fines, retirez délicatement un cerveau du HBSS, absorbez le tampon excédentaire à l’aide d’un essuie-tout ou de papier filtre, puis placez le cerveau dans l’agarose à bas point de fusion. Utilisez ensuite la pointe d’une pipette pour faire tourner le cerveau à l’intérieur du moule afin de maximiser le contact entre l’agarose et le tissu. Une fois tous les cerveaux transférés, positionnez chaque cerveau dans une orientation et une profondeur approximativement identiques dans son moule respectif.

Les aros vont se solidifier en environ cinq minutes. Travaillez donc rapidement. Laissez les aros se solidifier complètement en les incubant cinq minutes supplémentaires sur de la glace.

Retirez l'excès d'aros avant de monter les blocs. Ensuite, fixez les blocs d'agros les uns aux autres à l'aide d'un adhésif plastique à prise rapide, en veillant à ce que chaque cerveau dans l'empilement soit positionné avec ses bulbes olfactifs vers le haut. Une fois les blocs fixés, taillez l'aros afin de garantir que chaque cerveau sera sectionné par le vibratome.

Ensuite, les plonger immédiatement dans du HBSS glacé. Pour découper les blocs, régler la vitesse du vibratome sur une faible valeur, environ la moitié du maximum, et régler la fréquence de vibration de la lame au niveau le plus élevé. Ensuite, produire des tranches coronales de 250 microns d'épaisseur, récupérer les tranches à l’aide d’une spatule fine courbée et les transférer dans des puits pour tissus à l’aide d’un pinceau fin ou de pinces.

Si le tissu tombe en dehors de l'agarose, le contact entre le tissu et l'agarose n'a pas été suffisamment établi dans une hotte de culture cellulaire ; préparez une plaque de six puits contenant 1,8 millilitre de milieu de culture de tranches par puits, puis placez un insert organotypique avec du code de lysine polycationique de laminine dans chaque puits. Ajoutez 500 microlitres de milieu de culture de tranches au-dessus des inserts de tranches organotypiques. Transférez ensuite jusqu'à cinq tranches dans chaque insert.

Ensuite, retirez tout excès de milieu situé au-dessus des tranches afin de garantir la préservation de leur morphologie au maximum et de minimiser la mort cellulaire. Il est important de maintenir une interface air-liquide saine et de veiller à ce que les tranches ne flottent pas dans le milieu. Enfin, incubez les tranches à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié.

Remplacez la moitié du volume de milieu sous la membrane tous les deux jours. Les tranches ne doivent pas flotter sur le milieu ; les neurones exprimant les constructions électroporées peuvent être visualisés dès huit heures après l'électroporation, après le nombre de jours de culture souhaité. Fixez les tranches directement sur la membrane pour l'analyse.

Lavez chaque insert organique typique avec du PBS tiède pendant cinq minutes. Effectuez trois lavages au PBS au total, puis fixez le tissu avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant une heure à quatre degrés Celsius. Après la fixation, les tissus peuvent être analysés à l'aide de marqueurs cellulaires ou simplement colorés avec la coloration de hooks. Après une heure, lavez les tranches avec trois lavages de dix minutes chacun dans du 1X PBS.

Ensuite, rendre les tranches perméables pendant deux heures à température ambiante dans une solution de sérum de chèvre à 10 % dans du XPBS 1× sous agitation douce. Puis, colorer les tissus avec les sondes pendant une heure à température ambiante sous agitation douce. Éliminer le colorant par trois lavages de 10 minutes chacun dans du XPBS 1× sous agitation douce, en attendant.

Placer les lames en verre dépoli dans une chambre à eau suffisamment profonde pour immerger les tissus une fois déposés sur les lames. Pour monter les sections, commencez par découper librement la membrane avec un scalpel.

Deuxièmement, à l’aide de pinces fines, transférer jusqu’à cinq tranches liées à la membrane sur chaque lame immergée dans l’eau. Troisièmement, éliminer l’excès d’eau de chaque lame. Quatrièmement, appliquer une goutte de solution de montage sur chaque tranche de cerveau.

Et enfin, placez délicatement une lame couvre-objet au-dessus des tranches et retirez toutes les bulles d'air. Les tranches sont alors prêtes pour la microscopie, selon la quantité d'ADN électroporé et le stade embryonnaire. Lors de l'électroporation, l'efficacité de transfection s'est révélée variable.

Huit heures après la transfection avec un inhibiteur P, les cellules du vecteur GFP ont commencé à exprimer la GFP. Pendant une période de culture plus longue, les cellules subissent une séquence normale d'événements neurogéniques incluant la prolifération, la migration et la différenciation neuronale précoce. Ces tranches ont conservé leur morphologie pendant cinq jours, à condition que l'interface air-milieu soit bien maintenue lors de la réalisation de cette procédure.

Il est important de réaliser l'ensemble de l'expérience, du moment où l'animal est euthanasié jusqu'au moment où les tranches sont placées dans les inserts à membrane, en moins de deux heures afin de minimiser la mort cellulaire suite à cette procédure. D'autres manipulations, telles que l'ajout de facteurs exogènes à la lyse organotypique, peuvent être effectuées pour répondre à des questions comme : quel est le rôle des différents facteurs de croissance ou des agents pharmacologiques dans les divers mécanismes de neurodéveloppement ?