Évaluer les changements métaboliques hépatiques pendant la colonisation progressive des axéniques de souris par ¹ H NMR Spectroscopy

L'objectif de cette procédure est d'évaluer l'impact d'une colonisation progressive sur le métabolisme hépatique de l'hôte. Cela est réalisé en colonisant d'abord progressivement des souris axéniques. Le processus de colonisation est suivi par l'évaluation de l'excrétion urinaire de cocométabolites microbiens au moyen de la spectroscopie RMN.

Après le suivi du processus de colonisation, une biopsie hépatique est prélevée chez la souris et préparée pour le profilage métabolique. Le profil métabolique hépatique peut ensuite être obtenu à partir de la biopsie intacte par spectroscopie RMN à haute résolution avec rotation à l'angle magique, non destructive. En définitive, cette utilisation de la spectroscopie RMN du proton révèle divers métabolites impliqués dans des voies métaboliques telles que les voies énergétiques et du stress oxydatif.

Ainsi, cette expérience peut fournir des informations sur les fonctions hépatiques durant la colonisation. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme le rein. Pour coloniser les animaux, retirez les souris axéniques des isolateurs et hébergez-les dans une salle d'élevage conventionnelle, dans des cages équipées d'un filtre placé devant les animaux conventionnels qui servent de témoins.

Ensuite, mélanger la moitié d'une portée âgée de trois jours, prélevée dans la cage conventionnelle témoin, avec la litière des animaux exempts de germes. Recueillir l'urine dans un tube microcentrifugé de 1,5 millilitre en tenant la souris au-dessus du tube, en aidant à la miction par un léger massage du tube digestif. Un minimum de 20 microlitres est nécessaire pour l'acquisition à l'aide d'une sonde RMN de cinq millimètres, mais il est recommandé d'utiliser 30 microlitres afin d'améliorer la qualité du profilage métabolique. Congeler rapidement l'urine dans l'azote liquide, puis la conserver à au moins moins 40 degrés Celsius jusqu'à l'analyse RMN.

Avant l'acquisition RMN, préparez une solution tampon de phosphate de sodium 0,2 molaire dans l'eau lourde. pH 7,4 contenant un millimolaire de TSP, mélangez 30 microlitres d'urine avec 30 microlitres de tampon phosphate de sodium. Transférez 50 microlitres de la solution mélangée dans un tube capillaire RMN de 1,7 millimètre à l'aide d'une seringue en verre de 50 microlitres équipée d'une aiguille métallique.

Veillez à éviter les bulles. Placez l'adaptateur capillaire sur le dessus du capillaire contenant l'échantillon d'urine et insérez-le dans un tube micro pour RMN de 2,5 millimètres destiné à une sonde RMN de 5 millimètres. Cette combinaison de tubes peut être utilisée comme un tube RMN standard de 5 millimètres pour l'acquisition du spectre.

Dans cette démonstration, un spectromètre RMN Bruer avancé à 700 mégahertz est utilisé pour recueillir les données. Acquérir des spectres RMN protoniques unidimensionnels en utilisant les paramètres décrits dans le protocole écrit. Après l'acquisition RMN, utiliser la tige d'extraction pour retirer le capillaire du tube RMN de 2,5 millimètres en vissant doucement l'adaptateur de capillaire afin de le sortir, suite à l'euthanasie des animaux comme indiqué dans le protocole écrit.

Préparez la biopsie hépatique. N'utilisez aucun produit contenant de l'alcool afin d'éviter toute contamination, et nettoyez les outils à l'aide d'eau ou d'une solution saline. Prélève les biopsies hépatiques à partir du lobe gauche pour des biopsies reproductibles.

Prélève de façon constante au centre du lobe gauche, en évitant les zones périphériques où le tissu est plus mince. Veille à ne pas perforer la vésicule biliaire en cas de fuite de bile. Lave immédiatement le tissu à l'eau ou avec une solution saline.

Congelez immédiatement les biopsies par trempe dans l'azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'analyse par RMN. Pour préparer la RMN HRMAS, insérez la troisième biopsie dans un rotor en zircone et complétez le volume avec de l'eau lourde pure pour le verrouillage RMN. Veillez à ne pas former de bulles, car elles pourraient altérer la qualité du shim et de l'acquisition des données. Insérez un espaceur en téflon de 50 microlitres à l'aide de la vis cylindrique.

Dévissez-le et étalonnez-le à l’aide du palmer de profondeur situé sur le côté court. Placez la broche filetée sur l’entretoise et vissez délicatement à l’aide du tournevis. Asséchez soigneusement, à l’aide d’un morceau de papier absorbant, toute trace d’eau résiduelle.

Ensuite, placez le capuchon en haut du rotor et insérez-le dans le compacteur de rotor. Appuyez fermement jusqu'à ce que le capuchon soit bien en place. Il ne doit subsister aucun espace entre le rotor et son capuchon. Marquez la moitié de la partie inférieure du rotor à l'aide d'un stylo-feutre noir afin de permettre la détection optique de la vitesse de rotation.

Une fois que le rotor a été suffisamment compacté, placez-le dans le spectromètre RMN et commencez à monter à cinq kilohertz. Ici, un spectromètre RMN avancé de 500 mégahertz est utilisé. Enregistrez le spectre RMN du proton en utilisant une séquence d'impulsions CP MG.

Selon les directives du fabricant, le doublet intense de glucose alpha et numérique à 5,22 parties par million pourrait être utilisé pour étalonner les spectres RMN obtenus. Pour démonter le rotor, commencez par retirer le bouchon à l'aide du retrait de bouchon, dévissez la goupille filetée, puis retirez l'entretoise en téflon. À l'aide de la vis cylindrique, l'appareil peut être lavé soigneusement à l'eau et au détergent.

L'apparition de co-métabolites microbiens intestinaux au cours du processus de colonisation est clairement illustrée dans ce spectre protonique d'un profil métabolique urinaire d'un animal colonisé depuis 20 jours. Cet animal n'excrétait aucun sulfate indolique et de très faibles quantités de phénylacétyl glycine, abrégée en PAG, ni de sulfate de quélone à l'état sans germe. Au fur et à mesure de la progression de la colonisation, ces trois marqueurs du métabolisme protéique par la microflore intestinale augmentent considérablement et atteignent un équilibre au jour 20.

En intégrant le pic spécifique du triplet PAG, il a été possible de quantifier l'augmentation de ce marqueur particulier au fil du temps. Ce diagramme représente la concentration moyenne de PAG pendant la colonisation pour un groupe de sept animaux, mesurée par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire protonique H-R-M-A-S-N-M-R. Le profil métabolique hépatique de deux souris avant et après la colonisation a été obtenu. Cette figure illustre bien les informations pouvant être déduites d'un profil métabolique fondé sur la A-M-A-S-N-M-R.

De nombreux acides aminés ainsi que des métabolites dérivés du métabolisme énergétique peuvent être visualisés. Ces profils contiennent également des informations relatives au stress oxydatif, au métabolisme des nucléotides et au métabolisme des méthylamines. Dans cet exemple, il est très clair que la souris axénique présente presque pas de glycogène et des quantités très faibles de glucose et de triglycérides.

En suivant cette procédure, plusieurs outils statistiques, tels que chemo, peuvent être appliqués afin de regrouper des échantillons logiques selon leur profil métabolique et de mettre en évidence des biomarqueurs associés à l'état métabolique.