Utilisation de la séquence d'arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des complexes ribosomaux liés aux chaînes naissantes, ou RNCs, associés aux ribosomes SEC TED 70 s et produits lors de la traduction dans un système cellulaire in vitro sans cellules. Cette isolation est réalisée en introduisant d'abord une séquence d'arrêt de 17 acides aminés provenant de SEC M à l'extrémité C-terminale du gène d'intérêt, puis en l'insérant en aval du promoteur transcriptionnel T seven. Ensuite, l'ARNm est transcrit à l'aide d'une réaction de transcription in vitro, puis purifié.

Ensuite, l'ARNm purifié est traduit dans un système d'extrait S30 d'E. coli en présence d'acides aminés radioactifs afin de marquer la protéine synthétisée ou le polypeptide naissant. Enfin, les seconds complexes ribosomaux Mr.Ed liés à la chaîne naissante sont isolés par centrifugation sur gradient de saccharose et fractionnement. En définitive, les résultats obtenus peuvent démontrer que les chaînes naissantes sont stables et liées au ribosome 70 S, grâce à une analyse par électrophorèse sur gel des polypeptides marqués isolés des fractions du gradient.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation d'ARNm dépourvu de codon stop, réside dans sa capacité à assurer avec une grande efficacité l'attachement de la chaîne polypeptidique naissante au ribosome 70 S durant la traduction et l'étape ultérieure de centrifugation. De plus, contrairement à la technologie du codon stop absent, cette méthode peut être utilisée avec une efficacité presque équivalente aussi bien dans des systèmes in vitro qu'in vivo. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine du repliement protéique traductionnel, telles que la manière dont différents intermédiaires de repliement traductionnel pourraient se former précocement durant la traduction, et contribue également à l'analyse de leur structure par des méthodes structurales directes ou indirectes.

Approches d'exploration et de détermination Cette technique peut nous aider à décrypter la voie du repliement des protéines sur le ribosome. Dans ce protocole, nous avons décrit l'isolement de chaînes naissantes de cristalline bine gamma B liées aux ribosomes 70 s. Toutefois, cette technique peut être utilisée pour l'isolement de diverses maladies de pratiquement n'importe quelle protéine d'intérêt.

Cette stratégie peut également être adoptée pour isoler des chaînes polypeptidiques tronquées de la derm Es. En général, une personne novice avec cette méthode pourrait éprouver des difficultés lors de l'étape de centrifugation en gradient de saccharose. Toutefois, pour une personne expérimentée, ceci ne devrait pas poser de problème. Nous avons décidé d'utiliser une deuxième séquence d'arrêt pour isoler les polypeptides naissants de la gamma B cristalline liés au ribosome 70S, après des tentatives initiales moins concluantes qui impliquaient l'utilisation d'un ARNm dépourvu de codon d'arrêt.

La technique ultérieure ne permet pas d'assurer la stabilité des complexes ribosome-chaîne naissante (RNC) durant les étapes ultérieures de centrifugation avec la même efficacité que la technique impliquant l'utilisation de la séquence d'arrêt SECM. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes relatives à la préparation du gradient et à la séparation des RNC peuvent être difficiles à maîtriser et exigent un certain niveau d'expertise afin d'obtenir des résultats reproductibles. La démonstration des manipulations sera effectuée par un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour réaliser la transcription et la traduction in vitro, commencez par un gène d'intérêt cloné dans un plasmide dérivé de T7 ou de SP6 afin de produire des complexes ribosome-chaîne naissante, ou RNCs.

Prolonger l'extrémité C du polypeptide cible en ajoutant la séquence inductrice d'arrêt provenant de M afin de s'assurer que le fragment polypeptidique s'extrudera hors du tunnel ribosomique. Ajouter un brin flexible riche en glycine et en sérine entre la protéine et la séquence d'arrêt SEC M pour préparer la transcription in vitro ; utilisez un enzyme de restriction qui coupe en aval du cadre de lecture ouvert afin d'obtenir une ADN matrice linéarisée, puis réalisez une électrophorèse sur gel AROS pour vérifier la digestion complète de l'échantillon. Après avoir vérifié la concentration optimale d'ADN, utilisez un kit de transcription à haut rendement selon les instructions du fabricant pour synthétiser l'ARN messager.

Utiliser la précipitation par chlorure de lithium pour purifier l'ARNm. Ensuite, analyser un échantillon sur un gel d'acrylamide ou d'agarose afin de vérifier sa pureté. Pour la traduction in vitro.

À l'aide d'un système E. coli dans de l'eau sans nucléase, ajouter un mélange d'acides aminés à une concentration de un millimolaire, en omettant la méthionine, 10 unités d'inhibiteur de ribonucléase, 20 microcuries de méthionine 35S, 20 microlitres de mélange réactionnel, 24 microlitres de tampon de reconstitution et 24 microlitres de lysat d'E. coli. Préchauffer la réaction en l'incubant à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter ensuite un à deux microgrammes d'ARNm et poursuivre l'incubation pendant 10 à 15 minutes supplémentaires à 30 degrés Celsius.

Arrêter la réaction en plaçant le mélange sur de la glace afin d'isoler les complexes ribosome 70 S liés aux chaînes peptidiques naissantes ou ncs. Déposer la réaction de traduction sur 4,5 millilitres d'un gradient de saccharose de 5 à 30 % dans 20 millimolaire de heaps, hydroxyde de potassium, pH 7,5, 15 millimolaire de magnésium, 100 millimolaire d'acétate de potassium et 1 millimolaire de DTT. Centrifuger à 41 000 tr/min pendant deux heures à 4 degrés Celsius. Après la centrifugation, fractionner le gradient de saccharose à l'aide d'un système programmable de gradients de densité et d'un détecteur d'absorbance réglé à 254 nanomètres.

Recueillir les fractions contenant les ribosomes 70 s pour une analyse ultérieure afin de déterminer si la protéine étendue SEC M reste associée au ribosome 70 s. Précipiter la protéine dans chaque fraction du gradient en ajoutant de l'acide trichloroacétique. Incuber les échantillons toute la nuit à quatre degrés Celsius ; le lendemain, centrifuger les échantillons à 14 000 × g pendant 15 minutes pour former un culot protéique, puis laver les culots dans un rapport de quatre parts d'acétone pour une part de tris à une millimolaire, HCl pH 7,6.

Séchez les culots à l'air, puis resuspendez-les dans un tampon de charge pour électrophorèse SDS-PAGE. Séparez les échantillons par électrophorèse SDS-PAGE Tris-Trice, puis fixez et faites sécher les gels, et soumettez-les à une autoradiographie et à une imagerie phospho, comme illustré ici. Après la traduction in vitro, les ribosomes 70 S ont été isolés par centrifugation sur gradient de saccharose et fractionnement, afin de garantir que la protéine cristalline gamma B reste stablement liée au ribosome.

Les fractions contenant les particules 70 s ont été regroupées, désalinisées par échange de tampon, puis soumises à un cycle supplémentaire de centrifugation sur gradient de saccharose. Les résultats présentés ici suggèrent que le SEC M peut induire efficacement l'arrêt traductionnel des RNC de la cristalline gamma B. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée de travail, à l'exception de l'analyse par électrophorèse sur gel de la chaîne naissante, qui implique généralement une étape de précipitation à l'acide trichloracétique (TCA) effectuée pendant la nuit.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est évidemment essentiel d'éviter toute contamination par les ARN à n'importe quelle étape. Une contamination par les ARN peut affecter l'efficacité traductionnelle de l'extrait et entraîner le relâchement du polypeptide naissant à partir du ribosome 70S. En suivant cette procédure, on peut obtenir des complexes NAST et des polypeptides de longueur prédéterminée stables associés au ribosome 70S, selon l'objectif final recherché.

Ces complexes peuvent être utilisés à diverses fins, telles que la détermination de la conformation des chaînes naissantes liées au ribosome à l’aide d’approches directes et indirectes comme la RMN ou la FRET, ou encore l’analyse de la liaison de facteurs et de ligands après leur mise au point. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie structurale et du repliement des protéines, leur permettant d’explorer la conformation de protéines entières liées au ribosome, ainsi que des intermédiaires de repliement co-traductionnels. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation et de l’isolement de polypeptides naissants, stables et liés au ribosome 70 S, qui peuvent ensuite être utilisés pour répondre à diverses questions dans le domaine du repliement protéique traductionnel.

N'oubliez pas que le travail avec des isotopes radioactifs et des acides aminés marqués, tels que, par exemple, la méthionine A 35, exige des précautions particulières et doit toujours être pris en compte lors de l'exécution de cette procédure.