Transfert de gènes à l'oreille de souris en développement intérieur par

Jane a transféré à l'oreille interne de souris en développement par électroporation in vivo Ling Wang, Han Jang et John Burgandy, Centre de recherche sur l'audition de l'Oregon, Université des sciences de la santé de l'Oregon. D'accord. Je m'appelle John Burgandy. Mon laboratoire est situé au Centre de recherche sur l'audition de l'Oregon à l'Université des sciences de la santé de l'Oregon.

Je m'appelle Ang. Je suis un affiché dans le laboratoire de John. Je suis également Ang dans le laboratoire de John en tant qu'assistant de recherche.

Notre présentation est divisée en quatre parties. La première concerne la laparotomie ventrale. Nous démontrons l'utilisation de la pentobarbital sodique comme anesthésique, la méthode pour évaluer l'adéquation de l'anesthésie, la protection cornéenne, la préparation du site chirurgical, la désinfection, la fiche de données pour la chirurgie expérimentale chez la souris, l'ensemble du dispositif chirurgical, l'incision médiane ventrale à travers la peau et la paroi abdominale, ainsi que l'extériorisation des cornes utérines.

La deuxième partie concerne la microinjection intratubarienne. Nous démontrons l'éclairage transversal de l'embryon, le réalignement de l'embryon, la microinjection, la fabrication de la pipette, ainsi que la microinjection dans l'Otis aux jours embryonnaires 11,5 et 12,5. La troisième partie porte sur l'électroporation in vivo.

Nous démontrons la disposition des électrodes en style rame, et l'électroporation du souriceau de 11,5 jours de développement. La partie quatre présente des résultats représentatifs. Nous montrons l'expression de la GFP dans les oreilles internes à un stade embryonnaire tardif et au début de la vie postnatale.

Cela résulte de l'électroporation in vivo de l'Otis avec un plasmide d'expression au jour embryonnaire 11,5, première partie : laparotomie ventrale. La femelle gestante est maintenue fermement en saisissant la peau située derrière le cou, la queue et le membre postérieur gauche. Une injection intrapéritonéale d'anesthésique à base de pentobarbital sodique est administrée après avoir passé l'abdomen avec de l'éthanol à 70 %.

La souris est placée dans sa cage d'origine pendant quatre à cinq minutes afin de permettre à l'anesthésique d'agir. Des pinçures au niveau du pied et de la queue sont utilisées pour évaluer l'adéquation de l'anesthésie. Cette femelle réagit encore au pincement de la queue et nécessite deux minutes supplémentaires avant de devenir insensible aux stimuli nocifs.

Une pommade ophtalmique stérile est appliquée sur les yeux pour protéger les cornées de la dessiccation. Nous préparons le site chirurgical dans une hotte de chimie afin de minimiser la propagation des poils et des squames. Les poils sont rasés à l’aide d’une lame fine afin d’exposer la peau recouvrant la paroi abdominale.

La suppression complète du pelage facilite la cicatrisation de l'incision en postopératoire. La désinfection de la peau abdominale s'effectue par des passages alternés d'éthanol à 70 %, de Bétadine et d'éthanol à 70 %. Effectuez toujours les passages de l'avant vers l'arrière et utilisez une boule de coton chirurgicale ou un applicateur à embout de coton neuf.

Pour chaque passage, nous évaluons la profondeur et la qualité des respirations pendant la désinfection afin de garantir que la souris est inconsciente. Après le deuxième passage au 70 % d'éthanol, nous plaçons immédiatement la souris, face ventrale vers le bas, sur un champ stérile et la positionnons sur un tapis chauffant pendant deux à trois minutes afin de la réchauffer. C'est un moment opportun pour enregistrer les données préopératoires sur la fiche de chirurgie expérimentale chez la souris. Nous avons joint notre fiche de données de chirurgie expérimentale chez la souris en tant qu'information supplémentaire.

Envisagez d'inclure la fiche de données et votre protocole de soins aux animaux afin que le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux puisse examiner la manière dont vous allez surveiller les données préopératoires, opératoires et postopératoires. Nous complétons une feuille de registre pour chaque sujet chirurgical. Nous préférons réaliser la chirurgie dans un environnement stérile, bien que cela ne soit généralement pas requis pour les rongeurs.

La surface de travail est séparée du moteur du ventilateur et du boîtier de la chambre de pression, de sorte qu'aucune vibration n'est transmise à l'utilisateur. Lors de la microinjection, nous avons joint en information complémentaire un schéma des modifications apportées à notre hotte à flux laminaire afin de faciliter le transfert génique in utero ; les changements essentiels sont des découpes basses pour le défi de type « low wat », des emplacements pour l'éclairage directionnel et des prises cachées pour les cordons d'alimentation des instruments, ainsi qu'un trajet de routage pour les circuits électriques auxiliaires. La salle chirurgicale comprend le sac de perfusion IV de Ringer lactate électrique, un bain tiède, un manipulateur XY, Z, un microscope stéréofluorescent, une source lumineuse à fibre optique et les instruments chirurgicaux.

Les pédales sont utilisées pour déclencher le micro-injecteur, l'électro-perturbateur et la mise au point. Les instruments chirurgicaux du microscope sont stérilisés dans un autoclave. Les instruments doivent être re-stérilisés entre chaque souris à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre ou en re-stérilisant le porte-aiguille dans l’autoclave.

Les ciseaux, les pinces en anneau et les pinces vasculaires sont les outils essentiels. Réaliser une incision médiane ventrale, saisir la peau avec les pinces vasculaires et exciser l'intégument à l'aide des ciseaux à embout sphérique, puis étendre l'incision de 10 à 14 millimètres. Identifier la bande blanche, avasculaire, de tissu conjonctif appelée ligne blanche et la ligne médiane ventrale de l'abdomen ; inciser la ligne blanche à l'aide des ciseaux à embout sphérique.

En prenant soin de ne pas blesser l'intestin ou les bourrelets graisseux inguinaux. Irriguer immédiatement l'abdomen avec une solution stérile de Ringer lactate préchauffée. Évaluer les sites d'incision dans la peau et la paroi abdominale en ce qui concerne les saignements.

La pression directe exercée avec une pince hémostatique arrêtera tout saignement mineur éventuel. Externez les cornes utérines droite et gauche à l’aide d’une pince à extrémités annulaires. Saisissez délicatement la corne utérine droite avec une des extrémités annulaires de la pince et tirez l’utérus vers l’incision médiane. Utilisez votre main libre pour manipuler doucement le côté latéral de la femelle afin de faciliter l’accrochage de l’utérus.

Les forceps ne sont jamais utilisés pour comprimer l'utérus et le tirer vers l'extérieur. Cela pourrait endommager le réseau vasculaire utérin ou les embryons. Répétez la procédure d'extériorisation pour la corne utérine gauche. Immédiatement, irriguez délicatement les cornes utérines nouvellement extériorisées avec une solution de Ringer lactatée préchauffée, et replacez doucement les gaines graisseuses ou les intestins s'ils s'extériorisent avec l'utérus.

Cela n'est pas fréquemment observé. Deuxième partie : micro-injection utérine. La femelle gestante est positionnée sous l'objectif à longue distance de travail, et une lumière à fibre optique souple est placée contre la paroi utérine.

L'utérus est doucement pressé avec un doigt de la main libre. Pour faciliter l'identification de l'orientation de l'embryon. La lumière du câble en fibre optique doit être à l'intensité minimale nécessaire pour évaluer précisément l'orientation de l'embryon.

Une lumière intense peut transmettre de la chaleur à l'utérus, ce qui pourrait provoquer des complications. Nous tenons la lumière à fibre optique et l'utérus d'une seule main, et utilisons un doigt de l'autre main pour repositionner l'embryon par palpation douce. Nous illustrons dans la vidéo suivante, par microscopie, trois séquences EC et les orientations embryonnaires courantes observées dans l'utérus.

Le spectateur verra la vue microscopique que nous observons lors de l'éclairage transmis, bien que, en noir et blanc, l'éclairage transmis de l'utérus permette de détecter l'orientation de l'embryon in vivo. Dans cet exemple, l'embryon est en position de la tête en bas, sa surface ventrale étant tournée vers le spectateur. En basculant l'utérus d'avant en arrière, nous pouvons identifier les membres postérieurs droit et gauche, la queue et l'œil gauche du céphalon.

Dans cet exemple, l'embryon se trouve de nouveau en position de la tête en bas, mais tourné d'environ 90 degrés par rapport à l'axe antéro-postérieur. En basculant doucement l'utérus d'avant en arrière, on peut observer les formes en forme d'aviron qui définissent le membre postérieur gauche et le membre antérieur gauche. Le cerveau postérieur est également visible.

L'embryon est en position verticale, son côté gauche tourné vers l'observateur. Le quatrième ventricule naissant est détectable comme une tache brillante dans le cerveau postérieur. Le céphalon de l'œil gauche, les quatre membres gauches et les membres postérieurs gauches sont également visibles.

Une pression douce sur l'utérus réoriente légèrement les embryons, permettant ainsi la détection du tronc principal de la veine céphalique primitive et de ses branches antérieure et postérieure, marquées respectivement par un astérisque blanc et noir. Comme nous le verrons, l'Otis se situe à mi-chemin entre les branches antérieure et postérieure de la veine céphalique primitive. L'Otis lui-même ne peut pas être vu à travers l'utérus par transillumination.

Nous démontrons dans deux séquences consécutives de microscopie vidéo comment réorienter l'embryon pour la microinjection à l'aide de l'Otis assist. L'objectif consiste à identifier les repères embryonnaires permettant d'interpoler l'emplacement de l'otis dans la région latérale de la tête. Mesen con, notre objectif est de réorienter l'embryon depuis la position dorsale vers la position latérale afin que nous puissions identifier la veine principale de la tête.

Le mésencéphale, le quatrième ventricule et le membre gauche sont visibles en position dorsale. Une pression douce sur l'utérus modifie l'orientation de l'embryon de la position dorsale vers la position latérale. L'œil gauche, le céphalon, le mésencéphale et le quatrième ventricule sont clairement apparents.

La veine principale de la tête et sa branche postérieure, indiquées par l'astérisque, sont également évidentes. La branche antérieure de la veine principale de la tête n'est pas clairement détectée. Notre objectif, une fois encore, est d'orienter l'embryon afin de pouvoir identifier la veine principale de la tête, mais avec un grossissement plus élevé adapté à la microinjection utérine.

Les vaisseaux utérins du ruban décidual et l'œil gauche sont visibles dans cette perspective latérale. Une pression douce sur l'utérus modifie la position de l'embryon, ce qui permet de détecter le quatrième ventricule de l'œil gauche. La veine céphalique primitive et sa branche postérieure, indiquée par l'astérisque, ainsi que la veine céphalique primitive et ses branches forment la silhouette des poteaux d'un but de football américain.

La vésicule otique ne peut pas être vue à travers l'utérus, mais elle se situe au centre des montants verticaux. Lynn a initié une séquence d'injection pour un embryon. Elle transillumine l'utérus, réoriente l'embryon pour une micro-injection et introduit dans le champ la micropipette de colorant vert rapide destinée à la micro-injection.

La pipette de microinjection est fixée à un porte-pipette lui-même maintenu par un micromanipulateur X, Y, Z. Le support magnétique du micromanipulateur est fixé à une plaque d'acier munie d'une base en téflon qui permet un positionnement grossier aisé de la pipette de microinjection. L'aiguille est avancée à l'aide du bouton de commande du micromètre avant sur le micromanipulateur, de manière appropriée.

Les pipettes fabriquées sont essentielles pour une microinjection peu traumatique dans l'embryon de souris au stade précoce de Otis. Nous tirons un capillaire en verre borosilicaté à paroi épaisse à l’aide d’un tireur de pipettes horizontal. La pipette obtenue, illustrée en A, est rompue manuellement à l’aide de forceps à environ la position de diamètre externe de 14 à 16 microns indiquée par la flèche en B. La cassure irrégulière de la pipette montrée en C est dentelée et fragile.

Nous affûtons la pipette à environ 20 degrés afin de rendre la pointe plus fine, comme indiqué dans le panneau D ; les paramètres pour l'étirage et l'affûtage des pipettes de microinjection sont fournis dans le texte accompagnant. Nous illustrons dans les deux prochaines séquences vidéo de microscopie la microinjection dans l'otique de souris aux jours embryonnaires 11,5 et 12,5. Notre objectif est de démontrer la microinjection utérine dans l'otique de souris au jour embryonnaire 11,5.

Tout d'abord, nous réalisons des injections dans les ovoïdes en l'absence d'utérus afin de montrer de façon non équivoque l'apparence d'une injection correctement ciblée. Ensuite, nous démontrons une authentique micro-injection transutérine. Pour cette première injection, l'utérus a été incisé de manière longitudinale pour permettre l'extrusion du sac viscéral ; la bande décidue recouvrant le sac vitellin viscéral a été retirée.

Le placenta reste attaché à l'utérus et l'embryon est vivant. Après avoir retiré localement l'utérus, on observe le quatrième ventricule, la veine principale de la tête et ses branches antérieure et postérieure, la pipette et l'emplacement approximatif du kyste en blanc. Au début de cette séquence d'injection, un débit sanguin est détecté dans le réseau vasculaire du sac vitellin viscéral.

La pipette est avancée à travers le sac vitellin viscéral et l'ADi est injecté dans le sinus, le canal endolympathique en position dorsale et la position des otiques au centre des montants verticaux. Les otiques se situent à mi-chemin entre les branches antérieure et postérieure de la veine céphalique primaire ; l'injection microscopique utérine dans les otiques de souris au jour embryonnaire 11,5 nécessite la détection de la veine céphalique primaire et d'au moins une de ses branches afin d'estimer la localisation de l'otocyste.

Dans cet exemple schématique, les deux branches, antérieure et postérieure, de la veine céphalique primitive sont détectées, la zone OUC étant indiquée en blanc. Une représentation plus réaliste de l'embryon correspond à celle où l'on observe le tronc principal de la veine céphalique primitive ainsi que l'une seulement de ses branches ; dans l'exemple présenté, seule la branche postérieure de la veine céphalique primitive est visible, mais cela suffit pour interpréter la position des otiques. Le PT est avancé à travers l'utérus et un colorant est injecté dans les otiques.

Nous attendons 30 secondes pour permettre au colorant de s'écouler de la cavité amniotique ; à ce stade, nous pouvons observer le conduit endolymphatique en position dorsale ainsi que le vestibule. Nous concluons par une vue à faible grossissement de l'embryon dont nous venons d'injecter la vésicule, afin de fournir une perspective anatomique : dans cette vue, on distingue le quatrième ventricule, l'œil gauche et le réseau vasculaire utérin. Nous démontrons une injection trans et une microinjection dans la vésicule otique de souris au jour embryonnaire 12, ainsi qu'une microinjection dans le quatrième ventricule naissant du cerveau postérieur.

La transillumination permet de détecter la veine principale de la tête dans cette vue latérale gauche ainsi que l’œil. La pipette est avancée à travers l’utérus jusqu’à la vésicule otique, où le colorant est injecté afin de remplir la lumière de celle-ci. Pour injecter le quatrième ventricule, on fait pivoter l’embryon de 90 degrés afin d’obtenir une vue dorsale du cerveau postérieur.

La vésicule gauche injectée se trouve désormais du côté gauche. La pipette est avancée à travers l'utérus et le vert de méthyle est mélangé avec le lor. Le dextran conjugué est injecté dans le quatrième ventricule.

Remarquez que le volume de colorant injecté n'atteint pas le mésencéphale in vivo. La fluorescence est évaluée après l'injection afin de valider la localisation du dextran dans le quatrième ventricule. L'embryon est ensuite réorienté d'une position dorsale à une position latérale.

Le canal lymphatique interne se situe juste en avant du quatrième ventricule dans cette vue latérale. La fluorescence in vivo valide la localisation du dextran dans le quatrième ventricule. À la naissance, nous dépistons les petits présentant une fluorescence verte dans le quatrième ventricule à l’aide d’une fluorescence en épifluorescence.

Les souriceaux observés au microscope stéréoscopique présentant une fluorescence verte dans leur cerveau postérieur possèdent un organe auditif interne qui a été modifié au cours de l'embryogenèse, troisième étape : électroporation in vivo. Après avoir rempli la vésicule avec le plasmide d'expression, l'utérus est irrigué fraîchement avec une solution de Ringer lactatée préchauffée. La transillumination facilite le centrage de la vésicule ODU dans le champ électrode.

La tête métallique de la lumière à fibre optique est retirée de la surface de l'utérus. Avant de lancer la série d'impulsions en onde carrée, nous présentons dans le prochain extrait de microscopie vidéo un cycle complet d'électroporation in vivo. L'électroporation du kyste otique de souris au jour embryonnaire 11,5 nécessite un positionnement délicat des électrodes de type palette sur l'utérus.

Dans cet exemple, la vésicule otique gauche a été remplie avec un plasmide d'expression et l'utérus a été récemment irrigué avec une solution de Ringer lactatée. La cathode est positionnée latéralement par rapport à la vésicule otique remplie et l'anode est positionnée médialement au début de la séquence d'électroporation ; la vésicule otique est centrée dans le champ des électrodes. L'utérus est doucement comprimé et l'impulsion en train d'ondes carrées est initiée à l'aide d'un commutateur à pédale.

Idéalement, de 60 à 100 milliampères de courant sont délivrés par impulsion. L'utérus est alors relâché et immédiatement irrigué. L'utérus fraîchement irrigué est replacé dans la cavité abdominale à l'aide d'une pression douce exercée avec la pince en anneau.

Une fois que l’utérus est internalisé, la cavité abdominale est rincée avec environ quatre mils de sérum de Ringer lactaté ; laissez environ un mil de sérum de Ringer lactaté dans la cavité abdominale afin d’aider à maintenir l’hydratation de la femelle, qui boira moins d’eau que d’habitude immédiatement après une chirurgie abdominale. La paroi abdominale, puis la peau, sont fermées à l’aide de sutures résorbables et d’un porte-aiguille. Notre porte-aiguille intègre une paire de ciseaux, ce qui simplifie la fermeture.

Nous préférons un point de suture en broderie aussi bien pour la paroi abdominale que pour la peau. Nous faisons une nouure sur deux points afin d'assurer un soutien supplémentaire au niveau du site d'incision. Nous administrons un médicament anti-inflammatoire non stéroïdien par voie sous-cutanée avant de placer l'animal dans la cage de récupération.

Consultez votre personnel vétérinaire pour déterminer quels analgésiques prophylactiques sont recommandés par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux. La femelle est installée dans un champ opératoire stérile et placée au sol de la cage de récupération chauffée. La cage de récupération contient du matériel de nidification, un tube rouge servant d'abri, de la nourriture pour rongeurs et une bouteille d'eau.

La cage est réassemblée avec une bonnette filtrante en haut le matin suivant la chirurgie. La femelle est bien toilettée, ambulatoire et capable de se tenir en équilibre sur ses membres postérieurs pour s'intéresser au couvercle ouvert de la cage. La ligne de suture au niveau de l'abdomen est propre, sèche et ne présente aucun signe de déhiscence, d'érythème ou de gonflement.

Nous avons joint un document qui traite de l'élaboration de protocoles de soins aux animaux pour le transfert génique in utero. Ce document contient des formulations qui pourraient s'avérer utiles lors de la conception d'un protocole spécifique à votre établissement, en consultation avec votre comité de soins et d'utilisation des animaux. Partie quatre, résultats représentatifs.

Les panneaux A et B illustrent un exemple représentatif de cochlée provenant d’un pup âgé de six jours après la naissance, dont l’Otis a été injecté à un plasmide d’expression de la protéine fluorescente verte améliorée au dixième jour et demi de développement embryonnaire, puis électroporé. La paroi latérale de la cochlée a été retirée du milieu et de l’apex. Seule l’expression de la GFP est observée depuis la base jusqu’au milieu de la cochlée et suit la distribution du marqueur des cellules ciliées, la myosine sept A, montrée dans le panneau B. Le panneau C présente une projection confocale à faible grossissement du dixième jour de développement embryonnaire.

18,5 organes auditifs de souris immuno-marqués avec un anticorps anti-myosine VIIA ; les cellules transfectées sont réparties dans tout l'organe de Corti. Le panneau D montre une projection confocale en fort grossissement du jour embryonnaire 18,5, organe auditif de souris coloré avec la cinéine VII.

Une expression de GFP est détectée dans les cellules ciliées internes et externes, les cellules interphalangiennes, les cellules piliers et les cellules TER. Le transfert génique médié par électroporation vers l'Otis au 11,5e jour embryonnaire transfecte les progéniteurs donnant naissance à tous les types cellulaires composant l'organe de Corti.