Isoler LacZ cellules exprimant des tissus de la souris oreille interne par cytométrie en flux

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler des cellules positives à LAX Z à partir du cochlée de souris néonatale en utilisant la cytométrie en flux. Cela est réalisé en premier lieu en isolant un grand nombre de cochlées de souris en un laps de temps relativement court afin de maintenir la viabilité cellulaire et d'obtenir un tissu initial suffisant. Dans un deuxième temps, les cellules positives à LAX Z sont dissociées puis marquées afin de préparer le tissu pour le tri.

Les cellules sont ensuite triées par cytométrie en flux. Les populations résultantes, LAX Z élevée et lax faible, peuvent alors être utilisées pour des expériences supplémentaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur l'oreille, comme quelles sont les profils génétiques ou les populations cellulaires spécifiques présentes dans l'oreille interne.

La procédure sera démontrée par Taha Gen, étudiant en médecine de notre laboratoire. Commencez par remplir des boîtes de Pétri de 35 millimètres avec du HBSS et placez-les sur un bloc de glace. Ensuite, après avoir utilisé des ciseaux à iris pour décapiter 12 à 15 souris euthanasiées, âgées de 0 à 3 jours après la naissance, de lignée axon, deux laxy reporter et de type sauvage.

Placer les têtes sur une boîte de Pétri de 60 millimètres posée sur un bloc de glace. Ensuite, utiliser une pince Dumont n°5 et des ciseaux à iris pour exciser la mâchoire et la langue des têtes, puis sectionner la base du crâne au niveau du palais. Retirer maintenant la peau recouvrant le crâne et sectionner la base du crâne en insérant les ciseaux à partir de la partie inférieure du foramen magnum jusqu'au milieu du palais.

Effectuez une autre incision avec les ciseaux depuis le bord découpé du palais jusqu'à la partie supérieure du crâne, des deux côtés, en prenant soin de ne pas endommager la capsule otique. Ensuite, terminez l'isolement de l'os temporal en réalisant deux incisions angulées à 45 degrés, partant de la partie supérieure du foramen magnum et rejoignant la coupe coronale au niveau du palais dur.

Ensuite, placer les os temporaires isolés dans des boîtes de Pétri de 35 millimètres contenant du HBSS sur le bloc de glace et transférer le bloc de glace dans une hotte de dissection stérile. Puis, remplir une autre boîte de Pétri de 35 millimètres, cette fois avec du PBS, et la placer sur le bloc de glace. À l’aide de deux pincettes numéro 55.

Commencez la microdissection en retirant délicatement le cortex, le tronc cérébral et le cervelet de l'os temporal recouvrant la capsule otique. Ensuite, sans retirer la capsule otique, éliminez par petits morceaux des parties de la capsule cochléaire en partant de l'entrée du nerf vestibulocochléaire et en poursuivant vers l'intérieur de la capsule otique. Après avoir exposé la base de la cochlée, retirez délicatement l'organe de Corti ainsi que les tissus environnants.

Ensuite, en partant de la base, retirez tout ganglion spiral et stria vascularis résiduel et transférez la cochlée dans la boîte de Pétri remplie de PBS. Pipetez 50 microlitres de PBS stérile au centre d’un ou deux puits d’une boîte de culture non revêtue à six puits. Puis transférez au maximum 20 cochlées axin, deux laxy, dans chaque goutte de PBS.

Ensuite, préchauffez pendant environ deux minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius des aliquotes de 50 microlitres de trypsine à 0,125 %. Puis ajoutez la trypsine dans la cochlée, en prenant soin de ne pas agiter la boîte.

Incuber la cochlée à 37 degrés Celsius pendant huit minutes. Arrêter la trypsination en ajoutant 50 microlitres d'inhibiteur de la trypsine de soja à chaque goutte, puis ajouter un supplément de 50 microlitres de milieu complet après avoir réglé une pipette P200 sur 125 microlitres. Utiliser une pointe de pipette émoussée de 300 microlitres pour agiter doucement les cellules 80 fois, en prenant soin de ne pas former de bulles.

Ensuite, après avoir trituré chaque gouttelette, ajouter 200 microlitres supplémentaires de milieu complet à chacune. Faire maintenant passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 40 microns dans un nouveau puits de la même plaque à six puits, puis transférer les cellules de chaque puits vers des tubes fax standards individuels.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de cellules de type sauvage dans chacun des trois tubes, puis effectuez une dilution avec 300 microlitres de milieu complet pour le CUG uniquement. Comme témoin, diluez 10 microlitres d'axon, deux cellules LAX Z, dans 390 microlitres de milieu complet. Transférez les cellules axon restantes, deux cellules lax Z, dans des tubes fax contenant 400 microlitres d'OTs.

Ensuite, après avoir incubé les tubes dans une étuve humide à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, ajouter 200 microlitres de CUG dilué dans chaque tube fax approprié. Ensuite, en protégeant tous les tubes de la lumière, incuber les cellules dans une étuve humide à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes. Pendant l'incubation des cellules, pour la coloration, placer 10 millilitres de heaps fraîchement préparé plus de FBS dans un tube de 15 millilitres et placer le tube sur de la glace.

Ensuite, ajoutez 1,8 millilitre de la solution HEPES glacée dans chacun des tubes à centrifuger sous la hotte stérile avec les lumières éteintes afin de minimiser l'exposition à la lumière. Puis, centrifugez les cellules à 1200 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, retirez le surnageant et resuspendez les culots dans 300 microlitres de milieu complet.

Regroupez tous les aliquots de l'échantillon à trier, puis ajoutez de l'iodure de propidium dans chaque tube approprié jusqu'à une concentration finale de un microgramme par millilitre. Enfin, après avoir recouvert les cellules, remettez-les sur de la glace. Configurez les fenêtres de tri en collectant d'abord 1000 événements de cellules sauvages non marquées afin de déterminer la répartition cellulaire sur le diagramme de diffusion avant par rapport à la diffusion latérale.

Ajustez les paramètres de diffusion avant et latérale selon les besoins. Ensuite, effectuez la compensation à l’aide du type sauvage non coloré, du type sauvage coloré au PI et de l’axone coloré au CUG. Deux cellules LAX Z.

Remplissez deux tubes de centrifugeuse avec 500 microlitres de milieu complet. Ensuite, démarrez l'analyse avec les cellules de type sauvage marquées au PI et les cellules axon deux Lae CUG marquées, en utilisant la porte basée sur le tracé de diffusion avant par rapport à la diffusion latérale pour exclure les débris. Excluez les doubles et les agrégats à l’aide du tracé de la hauteur de diffusion avant par rapport à la surface de diffusion avant.

Ensuite, exclure les cellules mortes positives au PI en fonction du tracé de la surface de diffusion avant par rapport à la surface PE sci cinq. Pour chaque position de la démarche, établir un tracé de la surface de diffusion avant par rapport à la surface cascade ou bleu Pacifique. Analyser 10 000 événements provenant du tube d'échantillon trié contenant les cellules marquées au PI axon deux laxy et à l'UAGC en utilisant toutes les fenêtres définies avec les cellules de type sauvage à l'aide des tracés obtenus à partir des cellules de type sauvage.

Créer des fenêtres pour les cellules à forte intensité de cascade bleu représentant moins de 1 % du nombre total d'événements. Les fenêtres « Cascade Blue High » doivent maintenant contenir environ 15 à 20 % des cellules de l'échantillon Axon two laxy. À l'aide du tracé d'analyse des cellules Axon two laxy, créer une fenêtre pour les cellules les moins fluorescentes, soit 15 à 20 % des cellules, en utilisant la stratégie de fenêtrage susmentionnée.

Trier les cellules dans les tubes de tri contenant le milieu complet, en maintenant les tubes de collecte dans une chambre refroidie à quatre degrés Celsius pendant le tri. Enregistrer le nombre de cellules comptées par le cytomètre en flux pour chaque population sur ces deux figures. Les aires de diffusion latérale par rapport aux aires de diffusion avant des cellules de type sauvage dissociées à gauche et d'axon two LA Z à droite.

Les cellules cochléaires sont montrées. Remarquez la délimitation des groupes distincts d'événements de taille beaucoup plus grande que les événements plus proches de l'axe des Y, désignés comme la population négative pour les débris. Typiquement, de 40 à 45 % de cellules exemptes de débris sont récupérées à partir des cochlées de type sauvage et d'axin deux LAX Z dans ces deux panneaux.

La hauteur de la diffusion avant par rapport à la surface de la diffusion avant est utilisée pour exclure les doublets des débris précédemment sélectionnés. Les événements de la population négative s'écartant de la nature linéaire attendue du tracé sont exclus. Cette préparation donne généralement lieu à 71,1 % des événements à l'intérieur de la fenêtre définie. Ici.

L'iodure de propidium, détecté par le canal PE à cinq voies, est utilisé pour exclure les cellules mortes, comme observé sur ces diagrammes de dispersion. Environ 95 % des cellules triées étaient viables et n'ont pas capté l'IP dans ces panneaux. Le canal Cascade blue a été utilisé pour détecter le substrat fluorescent CUG, comme illustré sur la figure de droite.

En moyenne, les quelque 20 % supérieurs des cellules positives pour CUG correspondent aux cellules lae hautes, ce qui équivaut à environ 15 000 axones, soit deux cellules hautes pour 10 à 12 animaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer et isoler les cellules laxy hautes par cytométrie en flux à partir de tissus de l'oreille interne, tant pour des expériences de type Turing cellulaire que pour d'autres expériences telles que le profilage génique.