Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules IPS humaines par surexpression médiée par un rétrovirus des facteurs OCT4, SOX2, KLF4 et c-Myc, en utilisant un système rapporteur GFP. Cela est réalisé en ajoutant d'abord la quantité appropriée de rétrovirus individuels exprimant GFP. Ensuite, les cellules infectées par le virus exprimant GFP sont transférées dans des plaques revêtues de gélatine à 0,1 % contenant des fibroblastes embryonnaires de souris.

La troisième étape de la procédure consiste à remplacer le milieu par un milieu de culture de cellules souches embryonnaires humaines. Enfin, des colonies IPS dans lesquelles le gène GFP est silencé et qui présentent une morphologie similaire à celle des cellules souches embryonnaires humaines sont isolées. En définitive, les résultats montrent l'expression de marqueurs pluripotents endogènes par coloration immunofluorescente et par R-T-Q-P-C-R.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la coloration vitale avec des marqueurs de surface pluripotents et l'observation d'un changement morphologique, est l'iPad souhaitable. Les colonies cellulaires peuvent être facilement isolées en utilisant la perte d'expression de la GFP comme marqueur des cellules pluripotentes pour commencer la culture. Plaquez des fibroblastes humains dans du milieu pour fibroblastes un jour avant l'infection : ajoutez une fois 10 puissance 5 fibroblastes humains dans un puits d'une plaque à six puits. Le jour suivant, aspirez le milieu pour éliminer les cellules mortes et ajoutez deux millilitres de milieu frais pour fibroblastes contenant cinq microgrammes par millilitre de sulfate de protamine.

Ensuite, ajoutez soigneusement la quantité appropriée de chaque virus exprimant la GFP, correspondant à une multiplicité d'infection de cinq. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit, un jour après l'infection. Retirez le surnageant viral et lavez trois fois avec deux millilitres de PBS.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu pour fibroblastes trois jours après l'infection. Vérifiez la fluorescence GFP et complétez le puits avec deux millilitres de milieu pour fibroblastes. Le jour suivant, plaquez une fois dix puissance quatre par centimètre carré de fibroblastes embryonnaires de souris irradiés ou de cellules nourricières meth dans du milieu pour fibroblastes sur une boîte de Pétri de 10 centimètres recouverte de gélatine à 0,1 %.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, détacher les fibroblastes humains infectés avec un millilitre de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius et centrifuger pendant cinq minutes à 200 ×g. Resuspendre les cellules dans 10 millilitres de milieu pour fibroblastes et replater les cellules sur du gelatiné pré-enrobé à 0,1 % avec mfs. 24 heures plus tard.

Remplacez le milieu par du milieu de culture HESC et changez le milieu quotidiennement. Des colonies de type ESC commenceront à apparaître entre 20 et 27 jours après l'infection, une fois les colonies de type ESC visibles au microscope à fluorescence. Vérifiez l'absence de fluorescence GFP dans une colonie présentant une morphologie similaire à celle des HSC.

À l’aide d’une pipette de 10 microlitres, sélectionner individuellement les colonies d’iPS et les placer dans un puits d’une plaque de 12 puits revêtue de gélatine et de méthylcellulose, puis complétée avec du milieu HESC. Renouveler le milieu quotidiennement et passer les cellules en lavant la plaque avec un millilitre de DMM F12.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de collagénase et incubez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lavez les cellules deux fois avec le DM A MF 12. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu HESC frais.

Ensuite, utilisez un détacheur de cellules pour fragmenter les colonies en petits morceaux et détacher les cellules restantes de la plaque. Transférez les morceaux de colonies resuspendus dans un puits d'une plaque à six puits revêtue de gélatine et de fibroblastes de souris embryonnaires (MEF) et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux jours.

Pour analyser les cellules par immunofluorescence, les laver trois fois avec du PBS et les fixer avec du paraformaldéhyde 4 % pendant 20 minutes à température ambiante. Rincer délicatement les cellules trois fois avec du PBS et les permeabiliser avec du Triton X-100 0,2 % dans du PBS pendant 30 minutes.

Bloquez la liaison non spécifique en incubant les cellules avec du BSA à 3 % dans le PBS pendant deux heures. Incubez ensuite les cellules avec l'anticorps primaire toute la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez ensuite les cellules trois fois avec du PBS et incubez-les avec l'anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante à l'obscurité.

Lavez les cellules trois fois avec du PBS lors du dernier lavage. Ajoutez du DAPI et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Observez les cellules au microscope à fluorescence pour une analyse quantitative en temps réel.

Isoler par PCR l'ARN total à partir de CIP humaines dérivées de fibroblastes humains. En utilisant un kit d'isolement d'ARN. Synthétiser le brin complémentaire d'ADN par transcriptase inverse.

Ensuite, utilisez-le comme matrice pour la PCR quantitative afin de détecter les gènes de pluripotence. Les fibroblastes humains, BJ, infectés par un cocktail de rétrovirus portant OCT4, SOX2, KLF4 et c-Myc, présentent ici les modifications morphologiques observées durant la reprogrammation aux jours 5, 10, 14 et 21. Après 21 jours, les cellules commencent à présenter une morphologie semblable à celle des cellules souches embryonnaires humaines, et les cellules pluripotentes induites sont identifiées par la fluorescence GFP.

Les cellules souches pluripotentes telles que les ESC et les IPC expriment le matériel moléculaire nécessaire pour réprimer l'expression des gènes proviraux. Toutefois, les vecteurs rétroviraux utilisés ici expriment la GFP conjointement avec les gènes de reprogrammation via les LTR rétroviraux. Ainsi, les cellules exprimant continuellement la GFP sont considérées comme exprimant les transgènes sans silençage des gènes proviraux, comme observé fidèlement ici : les colonies de cellules iPS reprogrammées qui acquièrent le réseau moléculaire de pluripotence montrent l'absence d'expression de la GFP.

Cette figure montre l'analyse d'immunohistochimie de colonies dérivées de fibroblastes Detroit 5 51 à l'aide d'anticorps dirigés contre TRA 180 1, TRA one 60 SSEA four T four et nano, comme on peut le voir avec succès. Les CIP reprogrammées expriment tous ces marqueurs. En outre, une RT-PCR quantitative a été réalisée afin d'analyser l'expression génique et a révélé que T four SOX two, KLF four M et nano étaient significativement augmentés par rapport aux cellules fibroblastes parentales, mais comparables à ceux des CSH H nine.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment infecter le virus, identifier et prélever les cellules IPA entièrement programmées en lipides à l’aide de la microscopie fluorescente.