Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris avec un facteur de transcription Quatre, doxycycline inductible système de transduction lentiviraux

Bonjour, je m'appelle Brad Hamilton. Je travaille au sein du département de recherche et développement de STEM Gen. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de générer des cellules souches pluripotentes induites à partir de fibroblastes embryonnaires de souris.

Cette procédure peut être utilisée à la fois pour générer des cellules souches pluripotentes induites et pour étudier le processus de reprogrammation. Commençons donc. Commencez par ensemencer des fibroblastes embryonnaires de souris, ou cellules MEF, dans une boîte de 15 centimètres revêtue de gélatine, à une densité de quatre fois 10 puissance cinq cellules par boîte.

Ajoutez maintenant 30 millilitres de milieu de croissance pour méthylo, puis incubez les cellules pendant deux jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence d'environ 80 %. Une fois l'incubation terminée, aspirez le milieu et ajoutez 30 millilitres de milieu de croissance supplémenté en lentivirus concentré.

Balancer doucement la boîte pour assurer une répartition uniforme du milieu. Incuber les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu'à la fin de la transduction virale. Passons maintenant à la reprogrammation induite par la doxycycline.

Pour commencer le reprogrammation, 20 à 24 heures après la transduction, ajoutez de la trypsine sur les cellules transduites et centrifugez-les à 200 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez soigneusement le milieu du culot cellulaire et resuspendez les cellules dans un milieu de croissance. Une fois resuspendues, semez les cellules transduites à une concentration appropriée selon la taille de la boîte de culture cellulaire que vous utilisez.

Ici, nous utilisons 2,5 × 10⁵ cellules par boîte de 10 cm pour les expériences d'efficacité de reprogrammation et l'isolement des colonies de CIP, et 2 × 10⁴ cellules par puits dans des plaques à 4 puits pour les expériences d'immunochimie. Pour surveiller l'efficacité de transduction, incuber les cellules toute la nuit à 37 °C et 5 % CO₂. À ce stade, les cellules peuvent être congelées dans de l'azote liquide pour des analyses ultérieures si nécessaire.

Le lendemain, aspirez le milieu et remplacez-le par du milieu de croissance frais supplémenté avec de la doxycycline à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre. Nous incluons un témoin négatif contenant du milieu sans doxycycline. Incubez finalement les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Nous avons initié le processus de reprogrammation. En général, les colonies de cellules souches pluripotentes seront suffisamment développées pour être isolées après 16 à 22 jours.

Avant de démontrer cette procédure, nous devons d'abord vérifier l'efficacité de transduction en utilisant une méthode chimique permettant de déterminer cette efficacité. Un test d'immunochimie est réalisé sur les cellules replaquées dans des plaques à quatre puits, 48 heures après l'induction par la doxycycline. Tous les volumes indiqués dans ce protocole doivent être ajustés en fonction de la taille de la plaque de culture cellulaire ; commencez par laver délicatement les cellules.

Une fois avec du PBS ne contenant pas d'ions magnésium ou calcium, fixer les cellules avec 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 15 minutes. À température ambiante, laver délicatement les cellules deux fois avec du PBS. Ensuite, rendre les cellules perméables en ajoutant 500 microlitres de Tween 20 à 0,2 % froid dans du PBS et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.

Après avoir lavé les cellules deux fois supplémentaires, ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage pendant une heure à température ambiante afin de bloquer la liaison non spécifique des anticorps. Ajoutez ensuite 200 microlitres de l'anticorps primaire souhaité.

Ici, nous utilisons les marqueurs de pluripotentialité T 4K LF four, SOX two et cmic. Incubez les cellules toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Après avoir lavé doucement les cellules deux fois avec du PBS, incubez-les avec 200 microlitres d'anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante, en protégeant les plaques de la lumière.

Ici, nous utilisons les anticorps secondaires appropriés conjugués à des fluorochromes pour la visualisation, à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé après incubation. Lavez les cellules deux fois supplémentaires, puis ajoutez le DPI et incubez à nouveau pendant 10 minutes afin de visualiser les noyaux. Enfin, après un dernier lavage, ajoutez le milieu de montage antifa aqua avant d’imager les cellules au microscope à fluorescence inversé pour déterminer l’efficacité de transduction.

Commencez l'isolement et l'expansion des cellules souches pluripotentes. Après avoir initié le processus de reprogrammation, surveillez les cultures chaque jour et remplacez le milieu approprié toutes les 48 heures. Nous utilisons un milieu supplémenté en doxycycline pour cultiver les cellules pendant les 12 premiers jours, puis nous retirons ensuite la doxycycline du milieu.

Les colonies de cellules souches pluripotentes induites, ou IPS, sélectionnées manuellement pour expansion, sont au doxycycline. Les cellules indépendantes doivent être surveillées quotidiennement afin d'observer des changements morphologiques indiquant le processus de reprogrammation. Chaque expérience sera différente, mais les colonies sont généralement suffisamment grandes pour être isolées entre 16 et 22 jours après l'induction DS, soit la veille du début du processus d'isolement et de trypsination des colonies reprogrammées.

Préparer une plaque 24 puits en y semant une couche de cellules nourricières irradiées au gamma à une densité de cinq fois 10 à la puissance 4 cellules par puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, sélectionner manuellement chaque colonie de IPS et la trypsiner pour dissocier les agrégats cellulaires, puis replacer les cellules de IPS dans du milieu pour cellules souches embryonnaires murines dans les puits individuels de la plaque 24 puits préparée précédemment. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Changer le milieu toutes les 24 heures. Surveiller quotidiennement les colonies IPS pour leur croissance et leur fluorescence GFP. Nous avons incubé nos cultures pendant six jours avant de les conditionner dans des plaques à quatre puits pour l'analyse de la pluripotence.

Déterminez quels puits de la plaque à 24 puits expriment uniformément la GFP ; les puits présentant une bonne expression de la GFP peuvent être dissociés, triplés et repiqués au ratio de un à huit dans des plaques à quatre puits préalablement ensemencées avec des couches de cellules nourricières irradiées au gamma. Ces plaques peuvent ensuite être utilisées pour une analyse en immunocytochimie (ICC) de la pluripotence afin de commencer l'analyse de la pluripotence. Lavez délicatement les cellules deux fois avec du PBS ne contenant pas d'ions magnésium ni de calcium.

Ajouter 0,5 millilitre par puits de PBS glacé contenant 0,2 % de Triton X-100 et incuber les cellules pendant 10 minutes. Après trois nouveaux lavages au PBS, bloquer les liaisons non spécifiques avec 200 microlitres de tampon de blocage pendant une heure à température ambiante. Ajouter ensuite 200 microlitres de l'anticorps primaire souhaité.

Ici, nous avons utilisé SSEA-1, Nanog et OCT4 pour incuber les cellules toute la nuit à 4 °C. Après avoir lavé doucement les cellules deux fois, incubez-les avec 200 µL d'anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante, en les protégeant de la lumière. Nous utilisons ici les anticorps secondaires appropriés conjugués à la fluoro-force pour la visualisation, à l’aide d’un microscope fluorescent inversé ; après deux autres lavages, ajoutez du DPI et incubez les cellules pendant 10 minutes.

Après un lavage final, ajoutez une goutte de milieu antifa avant d’observer les cellules au microscope fluorescent inversé. Les colonies de IPS peuvent également être analysées pour leur activité de phosphatase alcaline à l’aide de kits disponibles dans le commerce. L’ensemble de lentivirus inducible pour souris stem gent docs peut être utilisé pour reprogrammer les MES en cellules IPS après la transduction de l’expression des facteurs de transcription.

Les gènes T four, SOX two, KLF four et seic peuvent être détectés dans les cellules traitées avec de la doxycycline, mais peu ou pas d'expression n'est détectable dans les cellules non traitées. Les changements morphologiques évolueront au fil du temps pour former des colonies plus grandes, de type cellules souches embryonnaires, avec des bords bien définis et une croissance tridimensionnelle. Lorsque le traitement par docs est interrompu, on observe un rétablissement notable de la morphologie cellulaire pour certaines colonies de type cellules souches embryonnaires.

Cependant, plusieurs des colonies ont conservé leur morphologie de IPS. Ces colonies de IPS, lorsqu'elles sont sélectionnées et repiquées, présentent une expression typique des marqueurs de pluripotence tels que la phosphatase alcaline, Nano T quatre et SSEA un.

Le type de cellules méthyliques utilisé dans cette expérience exprimait la GFP à partir du locus endogène nag. Lorsqu'elles sont reprogrammées vers un état de pluripotence, l'expression de la GFP peut donc être utilisée comme indicateur préliminaire d'un reprogrammation réussie. Nous venons de vous montrer comment induire le reprogrammation de fibroblastes embryonnaires de souris en cellules souches pluripotentes à l'aide d'un système antiviral inductible par la doxycycline et comportant quatre facteurs de transcription.

Lors de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que, lors de la conception d'expériences de reprogrammation, plusieurs variables doivent être prises en compte afin d'optimiser l'efficacité de la reprogrammation. Premièrement, il est possible de modifier le rapport entre le virus actif et le nombre de cellules lors de l'étape d'infection primaire afin d'augmenter ou de diminuer l'efficacité de la transduction, influant ainsi sur le nombre de virus intégrés dans la population cellulaire cible. Deuxièmement, ajuster la durée d'exposition des cellules aux docs peut influer sur le nombre de colonies IPS générées.

Troisièmement, la capacité proliférative des cellules cibles peut influencer la reprogrammation, car les cellules qui croissent et se divisent activement sont plus sensibles à la reprogrammation. Enfin, lors de l'adaptation du protocole à différents nombres de cellules ou à des boîtes de culture de tailles différentes, il est recommandé d'ajuster proportionnellement le nombre de cellules cibles à la surface de la boîte de culture. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.