En utilisant l'ARN médiée par la stratégie d'alimentation interférences à l'écran pour des gènes impliqués dans le règlement de la taille du corps du nématode

Ce vidéo montre une procédure permettant d'identifier les gènes qui régulent la croissance des vers et la taille du corps. À l'aide de l'interférence ARN ou ARNi pour inactiver les gènes candidats, on prépare d'abord des boîtes contenant des bactéries exprimant un ARN double brin ciblant les gènes d'intérêt. Des hermaphrodites au stade larvaire quatre sont transférés sur les boîtes d'ARNi.

Une fois qu’ils atteignent le stade de jeune adulte, ils sont transférés vers de nouvelles plaques d’ARNi pour y pondre des œufs. Après plusieurs heures, ils sont retirés, laissant des populations synchronisées d’embryons. Au stade de développement souhaité, la descendance est collectée et montée sur des lames.

Enfin, des images microscopiques des vers sont acquises. L'analyse de ces images met en évidence des modifications de la taille corporelle provoquées par l'inactivation du gène. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour identifier des régulateurs de la voie de signalisation TGF bêta, elle peut également être appliquée à d'autres voies régulant le développement post-embryonnaire chez *C. elegans*, telles que la voie de signalisation de l'insuline.

Commencez cette procédure en clonant les séquences du gène cible dans le vecteur L 4 4 4 0 A, un plasmide couramment utilisé pour l'ARNi chez les vers, puis transformez le plasmide recombinant dans la souche bactérienne HT one 15 DE three. Culturez les bactéries transformées sur des géloses LB contenant 25 microgrammes par millilitre de carbenicilline et 12,5 microgrammes par millilitre de tétracycline, puis sélectionnez une colonie isolée pour une utilisation ultérieure.

Entre-temps, transformer le vecteur vide L 4 4 4 0 dans la souche bactérienne HT one 15. Pour l'utiliser comme témoin dans les expériences, cultiver les bactéries transformées dans un millilitre de bouillon LB contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline, pendant toute la nuit à 37 degrés Celsius.

La tétracycline n'est pas ajoutée car elle diminue l'efficacité de l'ARNI. Ajouter cinq millilitres supplémentaires de bouillon LB contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline à la culture de nuit, puis incuber pendant quatre à six heures supplémentaires à 37 degrés Celsius. Une fois la culture prête, ensemencer 0,5 millilitre de bactéries expérimentales ou de contrôle sur les boîtes de vers RNAI étiquetées avec le nom du clone approprié.

Au moins deux plaques doivent être préparées pour chaque condition. Incuber les plaques toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain.

Une pelouse bactérienne doit être présente, exprimant un ARNi avec ou sans la séquence du gène cible. Les animaux utiliseront les bactéries comme source alimentaire. Une fois que les boîtes de culture avec ARNi sont prêtes, stérilisez la pointe d'un fil de platine à la flamme.

Ensuite, utilisez le fil de platine pour transférer six à dix larves de stade L4 ou C. elegans hermaphrodites à chaque plaque d'ARNi. Incubez les hermaphrodites à 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, les animaux seront de jeunes adultes.

Les transférer vers une nouvelle boîte RNAi correctement étiquetée et préparée. Incuber les boîtes à 20 degrés Celsius pendant quatre à six heures afin de permettre aux adultes de pondre des œufs. Après l'incubation, retirer tous les adultes de la boîte afin de synchroniser la descendance.

Une fois les adultes retirés, commencez à compter le temps. C'est le temps zéro. Incubez les boîtes à 20 degrés Celsius pour permettre aux animaux de croître jusqu'au stade de développement souhaité.

Ici, des adultes jeunes seront choisis pour l'analyse phénotypique. Pour les lignées à ARN interférentiel qui se développent à un rythme normal, une incubation de 72 heures est requise. Gardez à l'esprit que divers gènes affectent le développement de l'animal de manière différente, de sorte que les durées d'incubation peuvent nécessiter des ajustements.

Si l'ARNi provoque une croissance des animaux à un rythme différent, les jeunes adultes peuvent être identifiés comme étant ceux ayant au maximum 24 heures après le stade L4, avec un développement vulvaire terminé et deux à six embryons dans l'utérus, comme illustré ici. Pour identifier les autres stades de développement, l'expérimentateur doit utiliser le développement gonadique et vulvaire comme guide. Une fois que les animaux ont atteint le stade approprié, préparez-vous à évaluer les phénotypes de taille corporelle des vers traités par ARNi.

Placez ensuite deux couches de ruban adhésif coloré sur une lame en verre d'un millimètre d'épaisseur, comme indiqué ici. Préparez deux de ces lames en verre. Puis placez une lame en verre neuve entre les deux lames munies du ruban adhésif et appliquez une goutte de Agros à 2 % fondu dans l'eau.

Au centre de la nouvelle lame de verre, appuyez une deuxième lame de verre par-dessus afin de former un tampon d'agar mince. Une fois que l'agar a solidifié, retirez la lame supérieure. La lame avec le tampon d'agar est prête à recevoir les vers.

Étiquetez la lame avec le nom du clone. Ajoutez 10 microlitres de NaN₃ 25 millimolaire sur le tampon aros. Ensuite, à l’aide d’un fil de platine comme précédemment, transférez 30 à 40 animaux dans la solution d’azoture de sodium.

Pour les immobiliser, placez une lame couvre-objet par-dessus. Procédez de la même manière pour les animaux traités par ARNi portant le vecteur vide et le vecteur recombinant L 4 4 4 0. Ensuite, placez la lame micrométrique sous le microscope stéréoscopique muni d'un objectif 2,5 x.

À l'aide de Q Capture ou d'un logiciel similaire, capturer une image de la règle micrométrique et la sauvegarder. Ensuite, placer les vers sous le microscope et acquérir des images. Pour mesurer d'abord la longueur du corps, ouvrir l'image de la règle micrométrique dans le logiciel Image Pro.

Ensuite, cliquez sur Mesurer et sélectionnez Étalonnage. Puis choisissez l'Assistant d'étalonnage spatial avec l'option Étalonner l'image active sélectionnée. Cliquez sur Suivant.

Saisissez le nom de l'étalonnage et assurez-vous que les unités de référence spatiale sont définies en micromètres. Cochez ensuite la case Créer un étalonnage de référence et cliquez sur Suivant. Cliquez sur dessiner la ligne de référence.

Une barre d'échelle de référence apparaîtra. Repositionnez la barre d'échelle de sorte qu'elle corresponde aux extrémités du micromètre. Indiquez ensuite que la référence correspond à 1000 unités.

Cliquez sur OK. Ensuite et terminer. Une fois que le logiciel est calibré, ouvrez une image de ver.

Ensuite, dans le menu Mesure, sélectionnez Étalonnage, puis cliquez sur Sélectionner spatial. Dans le menu déroulant, sélectionnez le nom de fichier créé pour l'étalonnage du micromètre. Ensuite, dans le menu Mesure, sélectionnez Mesures dans la fenêtre qui s'ouvre.

Sélectionnez l'outil de dessin libre et, à l'aide de la souris d'ordinateur, tracez une ligne au centre du corps de l'animal, de la tête à la queue. La longueur sera indiquée dans la fenêtre. Répétez ce processus pour tous les animaux présents dans le champ.

Exporter les mesures de longueur vers un fichier Microsoft Excel ou tout autre logiciel statistique approprié. Analyser les données en calculant la moyenne et l'écart type pour chaque échantillon. Ensuite, comparer les résultats de chaque groupe à l'aide d'un test t de Student.

La protéine DBL-1, membre de la superfamille du facteur de croissance transformant bêta ou TGF-bêta, est nécessaire à l'activation de la voie de signalisation TGF-bêta. En réponse à l'activation du signal, les transducteurs intracellulaires de signal Smad transloquent vers le noyau et initient la transcription des gènes. Les C. elegans dans lesquels la voie TGF-bêta est perturbée présentent une taille corporelle réduite, incluant une longueur corporelle plus courte que celle des animaux de type sauvage.

Ainsi, des criblages de C. elegans permettent d'identifier des mutants de taille corporelle afin de mettre en évidence des composants et des modulateurs de la voie de signalisation TGF bêta, et de tester l'efficacité de l'ARNi par alimentation pour la détection de mutants de taille corporelle. L'ARNi a été utilisée pour inhiber les composants de la voie DBL-1, SMA-3 et SMA-6, dans quatre souches différentes de C. elegans.

Les souches de C. elegans testées comprenaient deux souches hypersensibles à l'ARNi : A1, Lin-15B et RF3, ainsi que la souche sauvage de référence N2 et la souche LIN-36, dont la sensibilité à l'ARNi est similaire à celle de N2, comme indiqué ici. Lorsque l'expression de SMA-3 ou de SMA-6 était perturbée, les animaux présentaient une taille corporelle significativement réduite par rapport aux animaux témoins, sauf dans le cas de l'ARNi ciblant SMA-6 chez Lin-36. Fond génétique de RF3.

Les longueurs corporelles des jeunes adultes après traitement par ARNi étaient de 84 à 95 % de celles observées avec le vecteur seul. Chez un fond génétique Lin-15B, les longueurs corporelles des jeunes adultes après ARNi étaient de 68 à 86 % de celles des animaux témoins. Toutefois, la souche lin-15B produit peu de progéniture.

Cela les rend inappropriées pour un criblage à grande échelle. Par conséquent, l'utilisation de la souche RF à trois souches est recommandée pour ces techniques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'identifier les gènes régulant la croissance et la taille corporelle à l'aide de la technique d'interférence RNI.