À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique
23 août 2012
Nous présentons une approche microfluidique pour l'expression de puces à protéines. Le dispositif se compose de milliers de chambres de réaction contrôlées par des micro-mécaniques vannes. Le dispositif microfluidique est couplé à une bibliothèque de gènes microréseau imprimé. Ces gènes sont ensuite transcrits et traduits sur puce, résultant en un réseau de protéines prêt à l'emploi expérimental.
L'objectif général de cette procédure est de créer un réseau protéique modulaire qui ne nécessite pas d'étape de purification, ce qui le rend compatible avec toute bibliothèque de protéines. Cela est réalisé en premier lieu en générant des gènes synthétiques par PCR d'assemblage. Ensuite, les gènes synthétiques sont disposés sur des lames époxy.
Pour fabriquer le dispositif microfluidique, utilisez du PDMS avec des moules de contrôle et d'écoulement en silicone. Ensuite, le dispositif microfluidique est aligné sur le réseau d'ADN imprimé. Enfin, un lysat de réticulocytes de lapin est introduit dans le dispositif microfluidique et les protéines sont exprimées.
En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent l'expression de milliers de protéines grâce à l'étiquetage par anticorps fluorescent. L'utilisation de la technique basée sur la microfluidique présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes, telles que les puces à protéines. Nous réalisons une puces à ADN, puis utilisons cellis pour synthétiser des protéines sur le dispositif.
Ainsi, nous n'avons pas besoin de purifier les protéines et celles-ci ne sèchent jamais. Elles restent fraîches tout au long de l'expérience. La technique microfluidique offre également une sensibilité accrue. Pour fabriquer le dispositif microfluidique, exposez les moules en silicone de commande et d'écoulement à la vapeur de chlorotriméthylsilène pendant 10 minutes afin de favoriser le relâchement de l'élastomère.
Après les étapes de cuisson, préparez un mélange d'élastomère à base de silicone et d'agent de réticulation selon deux rapports différents : cinq pour un et vingt pour un, respectivement pour les moules de contrôle et d'écoulement. Versez le PDMS à un rapport de cinq pour un sur la couche de contrôle. Dégazez la couche de contrôle et faites-la cuire pendant 30 minutes à 80 degrés Celsius.
Ensuite, appliquez par rotation le mélange de PDMS à un ratio de 20 pour 1 sur la couche d'écoulement à 2 600 tr/min pendant 60 secondes, puis faites-le cuire à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Séparez lentement la couche de commande du moule, en prenant soin de ne pas détacher le motif SU-8. Puis, à l’aide d’un scalpel, découpez le dispositif autour de son périmètre et utilisez une aiguille émoussée pour percer des trous permettant d’accéder aux canaux de commande sous un microscope.
Aligner manuellement les couches d'écoulement et de commande en commençant par le coin supérieur gauche et en positionnant la vanne bouton de la couche de commande au milieu de la chambre de réaction. Ensuite, aligner la première rangée et relâcher délicatement la couche de commande rangée par rangée. S'assurer que toutes les vannes bouton se trouvent au centre des chambres de réaction et que les vannes d'adressage et d'entrée croisent les canaux d'écoulement à la position correcte.
Répétez localement le processus jusqu'à ce que toutes les lignes soient alignées. Une fois l'alignement complet, relâchez toute tension dans le PDMS en le soulevant soigneusement par les côtés et les coins. Ensuite, faites cuire l'appareil pendant deux heures à 80 degrés Celsius après la cuisson.
Découpez autour du périmètre et décollez l'appareil à deux couches des orifices du moule d'écoulement afin d'accéder aux canaux d'écoulement pour générer des constructions d'ADN pour l'appareil. Réalisez une PCR pour produire des gènes synthétiques composés d'un promoteur T7, d'un site de liaison au ribosome, d'un cadre de lecture ouvert portant des étiquettes d'épitope différentes à chaque extrémité, et d'un terminateur T7. Pour préparer les gènes synthétiques en vue de leur disposition en réseau, préparez un mélange de polyéthylène glycol et de dihydraté de D-triose. Distribuez deux microlitres par réaction dans les puits d'une plaque 384.
Plaque de microtitration. Ajouter les gènes synthétiques dans une plaque de 384 puits. Puis ajouter de l'eau distillée jusqu'à un volume final de 20 microlitres.
Ensuite, à l’aide d’un spot de matrice, déposer une série de gènes synthétiques sur des substrats de verre revêtus d’époxy. Sous un stéréomicroscope, aligner manuellement le dispositif microfluidique avec la matrice génique en positionnant le spot d’ADN au centre des chambres à ADN. Puis aligner successivement les autres rangées.
Terminer par un réglage fin de l'appareil entier afin d'éliminer toute contrainte sur le PDMS et garantir une bonne liaison avec la matrice. Soulever localement. Enfin, lier l'appareil à la lame de verre en l'incubant toute la nuit sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius.
Des colorants alimentaires sont utilisés dans cette section à des fins de visualisation. Les valves de la couche de commande sont actionnées depuis l'ordinateur à l'aide de LabVIEW. Le script LabVIEW contrôle une série de microvalves à solénoïde via un boîtier de commande électronique.
Le bloc de vannes électromagnétiques est relié à de l'air comprimé, qui contrôle le débit d'air et la pression dans les vannes de commande du dispositif. À l'aide d'un tube en plastique souple de diamètre intérieur de 0,02 pouces et d'une broche en acier inoxydable, reliez le dispositif au bloc de vannes électromagnétiques. Remplissez les tubes d'eau doublement distillée et insérez la broche dans les orifices d'accès de la couche de commande.
Vérifiez que chaque tube est relié à son canal de commande correspondant. Pour activer les canaux de commande, exécutez l'application LabVIEW, réglez la pression d'air à cinq PS.I, puis appliquez la pression d'air en activant la vanne depuis le script LabVIEW. Cela permettra de pousser de l'eau dans les canaux de commande en PDMS afin d'identifier d'éventuels phénomènes de couplage entre les canaux de commande des dispositifs défectueux.
Remplissez d'abord les vannes du sandwich et celles d'adressage. En effet, les canaux de contrôle et les vannes sont remplis d'eau ; amorcer les vannes afin de bloquer les canaux d'écoulement situés en dessous. Augmentez d'abord la pression d'air à 15 psi, puis, dans le programme de visualisation du laboratoire, utilisez un ensemble d'interrupteurs marche-arrêt connectés à des vannes solénoïdes individuelles.
Activez toutes les vannes en mettant tous les boutons interrupteurs en position marche pour vous assurer que toutes les vannes sont ouvertes. Connectez un tube à l'une des entrées de débit, puis faites circuler de l'air dans l'appareil à une pression de quatre à cinq PSI. Cela permettra de débloquer les vannes collées sur la lame de verre.
L'appareil est désormais amorcé et prêt à être utilisé à des fins de visualisation. Un colorant alimentaire jaune est utilisé pour visualiser les réactifs dans cette section, et la solution incolore représente les hippies afin de faciliter l'auto-assemblage d'un réseau de protéines à la surface et d'empêcher l'absorption non spécifique à l'intérieur du dispositif microfluidique. Modifiez chimiquement la surface en raccordant d'abord un nouveau tube contenant la solution requise à l'un des canaux d'écoulement de l'appareil. Ensuite, reliez l'extrémité libre du tube au collecteur manuel et ouvrez le flux de pression d'air.
Chargez 40 microlitres de BSA liée à la biotine dans un nouveau tube et faites passer environ la moitié à travers le dispositif pendant 20 minutes. Utilisez du hippes à 50 millimolaire pour éliminer tout substrat non réactif entre chacune des étapes. Ensuite, faites circuler 25 microlitres de streptavidine pendant 20 minutes.
Au-dessus de la streptavidine liée, laver la BSA avec du HEPES pendant cinq minutes pour saturer la surface entourant le bouton, fermer la vanne du bouton et faire circuler le reste de la BSA biotinylée, puis laver à nouveau avec du HEPES pendant cinq minutes. Enfin, pour créer un réseau de capteurs anti-His sous le bouton, ouvrir la vanne du bouton et faire circuler 30 microlitres de Penta-His biotinylé pendant 20 minutes afin de former un réseau de protéines sur le dispositif. Ouvrir les vannes du col et faire circuler du réticulocyte de lapin.
Solution rapide de réaction couplée de transcription et de traduction acheminée par le dispositif vers la chambre d'ADN. Ensuite, fermer les vannes sandwich pour isoler chaque gène de son environnement et incuber le dispositif sur une plaque chauffante pendant 2,5 heures à 30 degrés Celsius. Puis marquer l'extrémité terminale des protéines avec l'anticorps C mix SI trois.
Enfin, à l’aide d’un scanner de puces à microarrays équipé d’un laser de 532 nanomètres et d’un filtre d’émission de 575 nanomètres, déterminez les niveaux protéiques. Cette figure montre les niveaux variables d’expression protéique sur une puce à protéines.
En général, 20 % d'une bibliothèque génique ne s'expriment pas à des niveaux détectables. Les niveaux de fond ont été déterminés à l'aide de chambres qui n'avaient pas été imprimées avec de l'ADN. Ainsi, les signaux provenant des chambres protéiques correspondantes sont dus soit au bruit, soit à l'absorption non spécifique des anticorps marqués.
Si elle est effectuée correctement, la vérification du dispositif prend quatre heures et l'expérience sur la puce prend cinq heures.
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Aperçu
Cette étude présente une approche microfluidique pour l'expression de puces de protéines, utilisant un dispositif comportant des milliers de chambres à réaction contrôlées par des valves micro-mécaniques. L'intégration d'une bibliothèque génique imprimée en microarray permet une transcription et une traduction directement sur puce, produisant ainsi une puce de protéines prête à l'emploi.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microfluidique
- Expression protéique
- Bibliothèques génétiques
Contexte
- Les puces à protéines sont essentielles pour divers dosages biologiques.
- Les méthodes traditionnelles nécessitent souvent des étapes de purification, ce qui limite la compatibilité.
- Les dispositifs microfluidiques peuvent simplifier le processus d'expression protéique.
- La PCR d'assemblage est utilisée pour générer des gènes synthétiques destinés à être immobilisés sur puce.
Objectif de l'étude
- Créer un réseau modulaire de protéines sans étapes de purification.
- Améliorer la compatibilité avec toute bibliothèque de protéines.
- Améliorer l'efficacité de l'expression protéique en utilisant la microfluidique.
Méthodes utilisées
- Génération de gènes synthétiques par PCR d'assemblage.
- Disposition de gènes synthétiques sur des lames époxy.
- Conception d'un dispositif microfluidique utilisant du PDMS.
- Circulation de lysat de réticulocytes de lapin dans le dispositif pour l'expression protéique.
Résultats principaux
- Un dispositif microfluidique fonctionnel a été créé avec succès.
- Des protéines ont été exprimées sur puce sans purification.
- La méthode a démontré une compatibilité avec diverses bibliothèques de protéines.
- La transcription et la traduction sur puce ont été réalisées efficacement.
Conclusions
- Cette approche microfluidique simplifie la création de puces à protéines.
- Elle élimine le besoin de purification, améliorant ainsi l'utilisabilité.
- La technique peut être appliquée à diverses banques de protéines pour la recherche.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette plateforme d'expression protéique microfluidique permet la production à haut débit de puces protéiques fonctionnelles sans purification, résolvant ainsi un goulot d'étranglement majeur dans la validation des cibles et le criblage d'interactions. En maintenant les protéines dans un état natif et non dénaturé sur la puce, la méthode autorise une détection fiable des interactions protéine-protéine, protéine-ADN et protéine-ARN. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en réduisant les faux négatifs dus à la perte ou au mauvais repliement des protéines durant la purification.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet la validation fonctionnelle de cibles en exprimant des protéines pleine longueur correctement repliées et portant des modifications post-traductionnelles adéquates.
- Valeur opérationnelle : Élimine les étapes de purification, réduisant ainsi la perte d'échantillon et augmentant le débit pour le criblage à grande échelle de bibliothèques.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en fournissant des données quantitatives d'expression pour des milliers de variants en parallèle.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des puces protéiques standardisées directement à partir de matrices d'ADN, assurant une reproductibilité entre les lots pour des dosages d'interaction reproductibles.
- Valeur opérationnelle : Intègre le clonage des gènes et l'expression protéique sur un seul dispositif microfluidique, réduisant au minimum le temps d'intervention manuelle et le risque de contamination croisée.
- Préparation du dosage : Produit des signaux fluorescents quantifiables compatibles avec les lecteurs de puces à ADN pour une cartographie d'interaction à haute densité.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet un profilage rapide des interactions protéiques pour des cibles pertinentes dans les maladies identifiées lors d'études omiques préalables.
- Alignement sur les biomarqueurs : Facilite le dépistage d'auto-anticorps ou d'événements de liaison thérapeutique à l'aide d'échantillons provenant de patients sur des puces d'antigènes exprimés.
- Réduction des risques précliniques : Permet une évaluation précoce des liaisons hors cible ou des profils de réactivité croisée avant de faire progresser les candidats.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la préparation de bibliothèques génétiques synthétiques au criblage d'interactions, permettant une transition fluide entre l'identification de la cible et la validation du candidat thérapeutique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en exprimant des gènes en réseau pour évaluer l'activité fonctionnelle des protéines sans biais de purification.
- Criblage : Fournit des puces de protéines standardisées et fraîchement préparées, prêtes à l'emploi immédiat dans des tests biochimiques ou biophysiques d'interactions.
- Analytique : Offre des lectures quantitatives basées sur la fluorescence permettant de comparer les niveaux d'expression et les affinités de liaison dans des milliers de conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les variants génétiques aux produits protéiques fonctionnels, permettant une corrélation avec des données phénotypiques ou cliniques.
- Réutilisation en entreprise : La plateforme microfluidique peut être reprogrammée avec de nouvelles puces d'ADN, soutenant des campagnes de criblage itératives dans plusieurs projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en exprimant les protéines à l'état natif, réduisant ainsi les artefacts liés à la purification ou à la dénaturation.
- Valeur opérationnelle : Permet le traitement parallèle de milliers de réactions dans un espace réduit, améliorant l'efficacité des réactifs et le débit.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'orientation (go/no-go) en générant rapidement des données d'interaction pour de grandes bibliothèques de variants.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des cibles selon des profils d'interaction complets et une fidélité d'expression élevée.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en fabrication de dispositifs microfluidiques, incluant le moulage de PDMS et l'alignement des couches.
- Dépend de l'accès à un équipement de dépôt de puces à ADN pour la génération de puces d'ADN et à des systèmes de contrôle microfluidique (par exemple, LabVIEW avec des vannes solénoïdes).
- Exige des protocoles standardisés pour la préparation de bibliothèques génétiques, incluant la PCR d'assemblage et le marquage par épitope pour la détection.
- Implique l'optimisation des durées d'incubation et des concentrations de réactifs (par exemple, lysat de réticulocytes de lapin, réactifs biotinylés) selon les objectifs spécifiques d'expression protéique.
- Est limité par l'accès aux installations de fabrication microfluidique et par le niveau de compétence technique requis pour un alignement et un assemblage précis des couches.
