Mélangeurs microfluidiques pour étudier repliement des protéines

L'objectif général de cette procédure est de mélanger rapidement deux solutions afin d'initier une réaction biochimique à l'échelle du microsecond. Cela est réalisé en fabriquant tout d'abord un mélangeur microfluidique. La deuxième étape consiste à lier une puce à un verre de couverture afin d'étanchéifier les canaux.

Ensuite, la puce est fixée sur un collecteur contenant les réservoirs de solution. La dernière étape consiste à imager la solution mixte par microscopie de fluorescence confocale. En définitive, la réaction biochimique est capturée à l'échelle de temps de la microseconde en convertissant la distance le long du canal de sortie en temps.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le mélange stop-flow est que le mélange n'est pas limité par la turbulence et se produit en quelques microsecondes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du repliement des protéines, comme par exemple à quel moment se produit l'effondrement hydrophobe ? Ling Woo, postdoctorante dans mon laboratoire, démontrera la procédure pour commencer la fabrication de puces microfluidiques de mélange.

Nettoyez d'abord quatre plaquettes de silice FU de quatre pouces avec une solution de piranha fraîche, comme décrit dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Ensuite, utilisez un four de dépôt chimique en phase vapeur sous pression réduite pour appliquer un revêtement de polysilicium d'environ un micron d'épaisseur pour chaque 10 micromètres de profondeur souhaitée des canaux microfluidiques finaux. Après un traitement supplémentaire des plaquettes tel que décrit dans le texte, appliquez par centrifugation une couche de 900 nanomètres d'épaisseur de résine photosensible Z 52 14, puis effectuez une pré-cuisson à 90 degrés Celsius directement sur un bloc chauffant pendant une minute ou dans un four à 110 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après avoir aligné un masque photolithographique, établissez un contact dur sous vide en exposant d'abord la résine photosensible à une lumière UV pendant plusieurs secondes. Ensuite, révélez le motif dans la résine photosensible conformément au protocole écrit. Examinez les motifs sur la tranche à l’aide d’un microscope et effectuez une cuisson dure à 115 degrés Celsius directement sur un bloc chauffant pendant deux minutes.

Ensuite, décharger les plaquettes avec un plasma Asher ou à l'oxygène pendant 2,5 minutes à une puissance RF de 100 watts. À l’aide d’un graveur ionique réactif profond, graver la couche de poly-silice jusqu’au silicium fondu sous-jacent. Retirer le photo-résistant restant et traiter les plaquettes conformément aux instructions du texte.

Mesurez la profondeur de gravure pour vous assurer qu'elle traverse entièrement le revêtement en poly. À l'aide d'un graveur ionique réactif profond capable d'attaquer l'oxyde, gravez la silice fondue sur une profondeur d'environ 10 micromètres par micromètre d'épaisseur du revêtement en poly. Nettoyez la plaquette avec l'appareil de matricage pendant quatre minutes, à une puissance RF de 100 watts, puis éliminez le polysilicium à l'aide d'un graveur au difluorure de xénon avant de percer des trous dans la plaquette. Appliquez ensuite par spin-coating une nouvelle couche de photo-résine d'un micromètre d'épaisseur afin de protéger les canaux lors des manipulations ultérieures.

Ensuite, fixez la tranche côté composants vers le bas sur une plaque de verre sacrificielle à l’aide de l’Aqua Bond 55. Veillez à maintenir le bonder exempt de bulles à l’aide d’un foret à pointe de diamant commandé par ordinateur et refroidi, ainsi qu’une solution de nettoyage micro 90. Cela empêche de petits fragments de verre de s’agglomérer aux canaux, ce qui provoquerait un colmatage de la puce lors de son utilisation.

Passez à la réalisation des trous d'entrée et de sortie sur chaque puce. Rincez la plaquette avec de l'eau déionisée en utilisant une seringue pour injecter de l'eau dans chaque trou. Ensuite, faites-la tremper dans de l'eau savonneuse pendant une heure après avoir retiré la photo.

Résist et collage tels que décrits dans le texte. Rincer la plaquette avec de l'eau déionisée et de l'eau tiède savonneuse. Rincer à nouveau chaque trou à l’aide d’une seringue, en évitant les motifs gravés après avoir fait passer de l’azote sur la plaquette.

Poursuivre le séchage dans une étuve sous vide réglée à 120 degrés Celsius. Inspecter les trous pour s'assurer qu'ils sont exempts de saleté et répéter les étapes de nettoyage si nécessaire. Les étapes suivantes doivent être effectuées en salle blanche.

Mesurez la profondeur des canaux à l’aide d’un profilomètre de surface optique ou mécanique. Nettoyez la plaquette ainsi qu’un couvre-objet en silice fondue comme décrit dans le texte, en salle blanche. Séchez soigneusement la plaquette avec de l’azote gazeux pendant au moins cinq minutes.

Placez ensuite la tranche côté composants vers le haut sur une pile de trois à quatre lingettes de salle propre placées sur une surface plane et dure, comme un petit morceau de verre. Répétez l'opération avec le couvre-objet. Saisissez le couvre-objet par le bord et retournez-le de manière à ce que la face polie soit orientée vers le bas, au-dessus de la tranche.

Alignez soigneusement les bords plats, laissez tomber délicatement la lame de couverture sur la tranche et laissez-la se positionner ; ajustez uniquement par un léger déplacement horizontal. Appuyez avec un doigt au centre de la tranche. On doit voir un front d'adhérence commencer à se propager vers l'extérieur.

Si nécessaire, appliquer une pression supplémentaire sur d'autres positions autour de la tranche pour faire progresser le front de collage. Après avoir placé les tranches scellées dans un four à haute température programmé selon le profil de température indiqué dans le texte, découper la tranche à l’aide d’une scie à trancher les tranches afin d’obtenir des puces individuelles. Le bloc collecteur destiné à contenir la puce de mélange et les solutions peut être fabriqué en plastique tel que du lexan ou du plexiglas, ou en aluminium.

Pour le contrôle de la température, fixez la puce au collecteur à l’aide de petits joints toriques et maintenez-la en place avec un anneau de retenue qui permet une vue optique claire du centre de la puce. Les rainures pour joints toriques doivent être plus peu profondes que la normale afin d’assurer un bon ajustement sans appliquer une pression excessive sur la puce. Une fois la puce montée, ajoutez des solutions dans les réservoirs central et latéraux, en veillant à libérer toutes les bulles éventuellement piégées au fond des puits.

Placer le collecteur sur un microscope inversé et examiner la zone de mélange à l’aide de l’oculaire ou de la sortie caméra. Une lampe torche à incandescence placée sur le dessus du collecteur fournira un éclairage suffisant. Utiliser un colorant ou une solution à indice de réfraction élevé dans le canal central pour visualiser le jet.

Étant donné que les volumes utilisés dans ce mélangeur sont très faibles, l'écoulement peut être contrôlé par une pression d'air appliquée au-dessus des puits de solution. Pour visualiser le jet, commencez avec une pression nulle dans le canal latéral (en livres par pouce carré) puis augmentez progressivement jusqu'à atteindre une pression égale à celle du canal central. Si l'un des canaux latéraux est obstrué, le jet sera dévié contre l'une des parois du canal de sortie.

Si un colmatage visible apparaît, il peut être désengagé en appliquant une pression ou un vide sur le canal de sortie à l’aide d’une seringue. Si des protéines ou d’autres matériaux organiques obstruent la puce, celle-ci peut être nettoyée par une immersion dans une solution piranha, en laissant agir toute la nuit. Introduisez un faisceau laser revêtu dans un microscope de recherche en utilisant un miroir dichroïque placé soit à l’intérieur, soit juste à l’extérieur du microscope.

Alignez le laser de manière à ce que le point focal soit visible dans l’oculaire ou sur la caméra, approximativement près de la zone de mélange. La fluorescence provenant de la protéine dans le mélangeur est collectée par l’objectif et dirigée à travers un miroir dichroïque, focalisée par une lentille sur un diaphragme et projetée sur un compteur de photons. Balayez la puce à l’aide d’un scanner piézoélectrique selon les axes x et y afin d’imager la zone de mélange.

Choisissez une position sur le jet et effectuez une analyse en X et Y pour trouver le point de focalisation au centre du canal dans la direction verticale. La profondeur de champ du microscope est beaucoup plus faible que la profondeur du canal, et le débit est uniforme dans le canal sauf à moins d'un micron des parois. Par conséquent, la résolution temporelle de la fluorescence observée est déterminée principalement par la taille du spot confocal.

Balayer horizontalement dans le canal de sortie par incréments de 100 microns le long du jet, en observant environ une milliseconde par position. Déplacer la platine du microscope de 80 à 90 microns le long du jet afin de capturer des instants ultérieurs. Alternativement, la lumière peut être détectée par un spectrographe et un CCD après le miroir dichroïque, à l’aide d’une lentille permettant de focaliser la lumière sur la fente d’entrée.

Étant donné que la collecte de données est plus lente qu'avec le compteur de photons, on image généralement d'abord le jet avec le compteur de photons, puis on mesure des points le long du jet à l'aide du spectrographe. Les données provenant du compteur de photons sont analysées en additionnant trois à cinq pixels autour du jet à chaque position, afin de créer un graphique de l'intensité en fonction de la distance. Le temps est calculé à partir de la distance en utilisant une vitesse calculée basée sur les pressions appliquées.

Comme étape finale, analyser les données du spectrographe à l'aide de l'une des méthodes décrites dans le texte. On voit ici une carte de contour de l'intensité dans la zone de mélange mesurée par le compteur de photons. Le fond dans le canal de sortie en dehors du jet devrait être proche du niveau de bruit du détecteur et n'est généralement pas soustrait.

Un fond plus élevé peut indiquer un mauvais alignement ou le fait que la protéine adhère aux parois du canal. Inversement, un jet qui semble courbé ou tordu, particulièrement près de la zone de mélange, indique une gravure insuffisante des buses. Un spectre résolu en temps est présenté pour la protéine ACell, la protéine de liaison au coenzyme A ou A CBP, marquée avec Alexa 4 88 et Alexa 6 47.

Les rectangles vert et rouge indiquent respectivement les longueurs d'onde désignées comme canaux donneur et accepteur. Ces données ont été soustraites du fond pour éliminer la charge sombre et le signal laser. Le signal de fond a été mesuré avec une pression au canal central équivalente à zéro livre par pouce carré.

Le temps de mélange peut être mesuré en suivant une réaction rapide beaucoup plus rapide que le mélange, comme la fluorescence du tryptophane inhibée par l'iodure de potassium. Étant donné que le jet est plus petit que la résolution optique du microscope, une forte diminution de l'intensité est observée dans la zone de mélange. Lors de la formation du jet, cette réponse de l'appareil peut être corrigée en effectuant une mesure de contrôle dans laquelle aucune condition de la solution ne change.

Le rapport entre les expériences de mélange et de non-mélange de la fluorescence de l'amide de N-acétyltryptophane est affiché sur cette figure. La ligne indique la concentration prédite d'iodure de potassium issue de la modélisation et des simulations multiphysiques par console. Le temps de mélange, mesuré comme étant le temps nécessaire pour que la concentration diminue de 80 %, est de huit microsecondes.

Ce graphique montre les variations du FRET dans la protéine A CBP après dilution du dénaturant, passant de six à 0,06 molaire. Ces données ne nécessitent pas d'expérience contrôle. Étant donné que le FRET est déjà un rapport et que la réponse de l'appareil a déjà été soustraite, le saut rapide vers T égal à zéro représente un changement rapide du signal de FRET durant le temps de mélange.

Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du repliement des protéines pour explorer les premières étapes de la formation de la structure des protéines.