Un test de dépistage fluorescent pour identifier des modulateurs de canaux Girk
24 avril 2012
Une procédure de dépistage en temps réel pour identifier les médicaments qui interagissent avec la protéine G-dépendants vers l'intérieur K redresseur + (Girk) canaux est décrite. Le test utilise le potentiel de membrane-colorants fluorescents sensibles pour mesurer l'activité du canal Girk. Cette méthode est adaptable pour une utilisation sur un certain nombre de lignes de cellules.
L'objectif général de cette procédure est d'identifier de nouveaux médicaments modulant les canaux grk. Cela est réalisé en premier lieu en ensemencant les cellules A TT 20 dans la plaque de 96 puits. La deuxième étape consiste à diluer les composés testés à l'aide du système automatisé de manipulation de plaques liquides Verset.
Ensuite, les composés test dilués sont appliqués aux cellules à l’aide du verset. La dernière étape consiste à insérer la plaque de 96 puits dans le lecteur de plaques fluorescentes Synergy Two, puis à injecter les solutions témoin et la somatostatine dans les puits. Enfin, le lecteur de plaques fluorescentes permet d’identifier les composés modifiant le signal fluorescent induit par la somatostatine, et donc de moduler les canaux Grk.
L'avantage de cette procédure par rapport aux méthodes existantes, telles que l'enregistrement en configuration patch, est qu'un grand nombre de composés peuvent être rapidement criblés pour déterminer s'ils modulent les canaux Gerk. Les implications de cette technique s'étendent au traitement de la douleur, car des composés activant le canal Gerk, ce qui conduit à l'inhibition de la transmission nociceptive FI, peuvent être identifiés. Démonstration de la procédure de revêtement. Les plaques de 96 puits et la mise en culture des cellules sont réalisées par Maribel Vasquez.
Un étudiant dans mon laboratoire commence cette procédure en cultivant les cellules hypophysaires A TT 20 dans du DMEM supplémenté avec 10 % de sérum de cheval à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Maintenir la culture en repiquant les cellules toutes les cinq à sept jours en utilisant une procédure de standardisation. Ensuite, recouvrir les puits de la plaque noire transparente.
Placer le fond de la plaque 96 puits avec 50 microlitres de poly-L-lysine. Laisser sécher les puits pendant 30 minutes dans l'incubateur. Ensuite, éliminer l'excès de poly-L-lysine et ensemencer les cellules dans la plaque 96 puits contenant 200 microlitres de milieu à une densité de 30 000 cellules par puits.
Après cela, conserver les cellules dans l’incubateur pendant trois à quatre jours. Utiliser un dispositif d’aspiration pour aspirer lentement le milieu de culture de la monocouche cellulaire, puis laver les cellules avec 200 microlitres de solution tampon normale. Ensuite, ajouter 200 microlitres de solution tampon contenant le colorant sensible au potentiel membranaire à chaque puits.
Incuber les cellules pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius. Après 40 minutes, retirer les cellules A TT 20 de l’incubateur et les laisser revenir à la température ambiante, puis aspirer l’ancienne solution tampon. Ensuite, ajouter une solution tampon fraîche contenant le MPD aux cellules.
Ensuite, utilisez le système de manipulation des liquides pour appliquer différentes concentrations des composés testés et des solutions témoins aux cellules. Dans la plaque 96 puits, incubez les cellules pendant cinq minutes avec les composés testés avant les mesures de fluorescence. Dans cette procédure, insérez la plaque 96 puits dans un lecteur de plaque fluorescent Biotech Synergy Two.
Obtenez le signal de fond fluorescent à une longueur d'onde d'excitation de 520 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 560 nanomètres. Ensuite, appliquez les ligands du récepteur GPCR ou la solution témoin aux puits afin d'activer les canaux GIR à l'aide du système d'injection Synergy Two. Puis recueillez les points de données à des intervalles de dix secondes pendant une période d'échantillonnage de 302 secondes.
Aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission. Calculez le facteur Z afin de déterminer la fiabilité du test. Des facteurs Z compris entre 0,5 et 1,0 indiquent que la qualité du test est excellente.
Les plaques dont les facteurs Z sont inférieurs à 0,5 sont exclues. Lors de l'analyse, les composés modulant le signal fluorescent sont testés à nouveau en présence de deux millimolaires de chlorure de baryum ou de 500 nanomolaires de terapine Q afin de confirmer la spécificité du canal potassique rectificateur entrant. Voici un signal fluorescent représentatif de HLB 0 2 1 1 15 2 mesuré au fil du temps dans les cellules A TT 20 suite à l'ajout de somatostatine ou d'une solution témoin. Le rapport de l'intensité fluorescente sur l'axe des Y a été calculé en divisant le signal en présence de somatostatine ou de la solution témoin par le signal de base mesuré avant l'ajout de somatostatine ou de la solution témoin.
On montre ici le traitement des cellules A TT 20 avec 500 nano molaires. La térapine Q inhibe la diminution du signal fluorescent induite par la somatostatine en se liant aux canaux G et en les bloquant. Et l'on montre ici le traitement des cellules A TT 20 avec 20 micromolaires de propafénone, qui inhibe également la diminution du signal fluorescent induite par la somatostatine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment identifier des médicaments modulant les canaux grk à l’aide d’un lecteur de plaques à fluorescence.
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Aperçu
Cet article décrit une procédure de criblage en temps réel permettant d'identifier des médicaments qui interagissent avec les canaux potassiques rectificateurs entrants activés par les protéines G (GIRK). Le test utilise des colorants fluorescents sensibles au potentiel membranaire pour mesurer l'activité des canaux GIRK, ce qui le rend adaptable à diverses lignées cellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Pharmacologie
- Neurosciences
- Électrophysiologie
Contexte
- Les canaux GIRK jouent un rôle crucial dans la signalisation neuronale.
- L'identification de modulateurs des canaux GIRK peut conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques.
- Les tests en temps réel améliorent l'efficacité du criblage de médicaments.
- Les colorants fluorescents fournissent une mesure sensible de l'activité des canaux.
Objectif de l'étude
- Développer une procédure de criblage de médicaments modulant les canaux GIRK.
- Utiliser un format à haut débit pour tester plusieurs composés.
- Améliorer la compréhension de la pharmacologie des canaux GIRK.
Méthodes utilisées
- Ensemencer 20 cellules A TT dans une plaque de 96 puits.
- Utiliser le système de manipulation liquide Verset pour diluer les composés test.
- Appliquer les composés dilués aux cellules à l’aide du Verset.
- Utiliser un lecteur de plaque fluorescent Synergy Two pour mesurer les réponses.
Résultats principaux
- Identification de composés modifiant les signaux induits par la somatostatine.
- Démonstration de l'adaptabilité du test à diverses lignées cellulaires.
- Modulation réussie de l'activité des canaux GIRK par les composés testés.
- Validation de l'efficacité du lecteur de plaques à fluorescence dans le criblage.
Conclusions
- Le test mis au point constitue un outil précieux pour la découverte de médicaments ciblant les canaux GIRK.
- Un criblage en temps réel peut accélérer l'identification de thérapeutiques potentielles.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour explorer les implications cliniques des composés identifiés.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cet essai permet l'identification à haut débit de modulateurs des canaux GIRK, soutenant la validation de cibles en neurosciences et en découverte de médicaments cardiovasculaires. En fournissant des signaux fluorescents quantitatifs en temps réel, il réduit la dépendance à l'égard de l'électrophysiologie à faible débit et accélère le passage du « hit » au « lead ». La méthode renforce la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en reliant les effets des composés à l'activité fonctionnelle des canaux dans un contexte cellulaire physiologiquement pertinent.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en mesurant la modulation fonctionnelle des canaux GIRK en réponse à des ligands de récepteurs couplés aux protéines G (GPCR).
- Valeur opérationnelle : Permet le criblage rapide de bibliothèques de composés afin d'identifier des activateurs ou inhibiteurs dotés d'une spécificité mécanistique.
- Valeur prédictive : Permet la réduction des risques liés à la cible en confirmant l'activité spécifique par des variations du signal de fluorescence corrélées à l'efflux de K⁺.
Développement de criblage et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Utilise des colorants sensibles au potentiel membranaire (DiBAC4(3) ou HLB 021-152) pour générer des signaux quantifiables en temps réel lors de l’activation des canaux GIRK.
- Reproductibilité : Le calcul du facteur Z (plage excellente : 0,5–1,0) garantit la robustesse du test pour la sélection des composés actifs et la reproductibilité des campagnes.
- Évolutivité : Compatible avec le format 96-puits et les systèmes de manipulation liquide (par exemple, Verset) pour la distribution automatisée de composés et le criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Les modulateurs identifiés pourraient orienter les stratégies thérapeutiques contre la douleur neuropathique, l’addiction et les arythmies cardiaques par l’inhibition neuronale médiée par les GIRK.
- Continuité translationnelle : Les signaux fluorescents établissent un lien entre la liaison à la cible et la réponse fonctionnelle, facilitant l’ancrage du phénotype en phase préclinique.
- Réduction des risques mécanistiques : La spécificité est confirmée à l’aide d’inhibiteurs comme le chlorure de baryum ou la térapine Q, permettant de distinguer les effets médiés par les GIRK de l’activité hors cible.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans la continuité de la découverte, allant de la validation de la cible à l'identification de composés initiateurs, permettant ainsi le criblage fonctionnel de modulateurs de GIRK avant leur optimisation ultérieure.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses en reliant l'activation des RCPA aux variations de fluorescence dépendantes des canaux GIRK, clarifiant ainsi la modulation de la voie de signalisation.
- Criblage : Offre une prête-à-l'emploi pour les tests grâce à un chargement standardisé en colorant, à l'application de composés et à la mesure cinétique de la fluorescence sur une durée de 300 secondes.
- Analyse : Produit des mesures quantitatives de variables dépendantes (rapports d'intensité de fluorescence) permettant la comparaison de la puissance et de l'efficacité des composés.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans les travaux précliniques en identifiant des composés modifiant l'excitabilité neuronale via les canaux GIRK, ce qui est pertinent pour les modèles de douleur et de dépendance.
- Réutilisation en entreprise : Plateforme adaptable à différentes lignées cellulaires et ligands de RCPA, favorisant sa réutilisation dans plusieurs campagnes de validation de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans la modulation de la cible en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans le criblage de médicaments sur les canaux ioniques.
- Valeur opérationnelle : Offre une standardisation, une reproductibilité et des données cinétiques en temps réel inaccessibles avec les tests en point final.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon en permettant une validation fonctionnelle précoce, réduisant ainsi le risque d'échec en phase avancée dû à l'absence d'interaction avec la cible.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des composés présentant une activité GIRK confirmée, en vue de leur progression vers l'optimisation du candidat-médicament.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire (cellules AT T20), en manipulation de colorants fluorescents et en utilisation d'un lecteur de plaque cinétique.
- Dépend d'un lecteur de plaque à fluorescence doté d'une fonction d'injection (par exemple, Synergy 2) et de réglages d'excitation/émission compatibles (520 nm/560 nm).
- Exige une standardisation du chargement du colorant, des durées d'incubation et des conditions tampons entre les puits et les plaques.
- L'adaptation à d'autres lignées cellulaires nécessite une validation de l'expression des canaux GIRK et de l'efficacité de chargement du colorant.
- Limite pratique : la spécificité du test doit être confirmée à l'aide d'inhibiteurs orthogonaux (par exemple, Ba2+, Terapin Q) afin d'exclure des variations de fluorescence non médiées par les GIRK.
