Conversion d'un test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage d'anticorps Multiplex

L'objectif général de l'expérience suivante est de convertir un dosage Eliza préalablement optimisé pour la cytokine TNF Alpha vers la plateforme Xap tout en évaluant des paires d'anticorps alternatives. Cette conversion est réalisée en couplant l'anticorps de capture du kit ELIZA, ainsi que trois autres anticorps de capture candidats, à quatre jeux différents de microsphères ou de billes mélangés ensemble. Ces quatre jeux permettent de tester simultanément les quatre candidats avec quatre anticorps de détection distincts afin de déterminer la meilleure paire d'anticorps.

Deux nouveaux dosages Xap sont réalisés à l'aide des deux paires d'anticorps les plus optimales. Les performances des dosages sont ensuite comparées à celles du dosage EISA d'origine en ce qui concerne l'intensité du signal, la gamme dynamique et la sensibilité. Les résultats montrent que des anticorps similaires peuvent avoir des comportements très différents dans les mêmes conditions et que plusieurs anticorps peuvent être criblés simultanément à l'aide du dosage Xap Luminex, révélant ainsi que ce dosage présente une sensibilité et une gamme dynamique accrues par rapport au dosage EISA.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le test ELISA est que les immunodosages basés sur le xap permettent au chercheur de tester plusieurs cibles, ou, comme dans ce cas, de tester plusieurs anticorps simultanément. Pour identifier le meilleur anticorps démontré. La procédure sera réalisée par Erica Lopez, scientifique associée chez Luminex Corporation.

Commencez ce protocole par la sélection et la préparation de quatre anticorps de capture et de quatre anticorps de détection spécifiques de la TNF alpha humaine, comme décrit dans le protocole écrit. Préparez également un anticorps de confirmation spécifique de l'espèce hôte des anticorps de capture. Portez les réactifs du kit de couplage d'anticorps à température ambiante.

Étiquetez quatre tubes à réaction avec les numéros de régions des billes sélectionnés pour la réaction de couplage. Transférez le contenu des quatre flacons de microbilles MagPlex dans les quatre tubes à réaction étiquetés. Lavez chaque jeu de billes deux fois dans 500 microlitres de tampon d'activation et activez chaque jeu de billes avec les solutions de sulfONHS et d'EDC comme décrit dans le kit de couplage d'anticorps.

Mode d'emploi : après une incubation de 20 minutes sur un agitateur rotatif, répéter l'étape de lavage précédente avec les billes maintenant activées, pour un total de trois fois, en utilisant 500 microlitres de tampon d'activation. Pour chaque lavage, préparer quatre solutions séparées de 500 microlitres, chacune contenant 7,5 microgrammes d'anticorps de capture dans du tampon d'inactivation.

Ajoutez ces quatre solutions d'anticorps de capture à leurs tubes à réaction respectifs. Vortexez immédiatement chaque tube et incubez pendant deux heures sur un agitateur rotatif. Répétez l'étape de lavage avec les billes maintenant couplées un total de trois fois avec 500 microlitres du tampon de lavage fourni avec le kit de couplage d'anticorps.

Après la dernière étape de lavage, ajouter 500 microlitres de tampon de lavage dans chaque tube à réaction afin d'obtenir une concentration finale de 5 millions de billes couplées à l'anticorps par millilitre, puis vortexer et soniquer les tubes à réaction pour disperser les billes. Compter le nombre de billes récupérées après la réaction de couplage à l’aide d’un compteur de cellules ou d’un hémocytomètre. Le rendement de la réaction de couplage est généralement supérieur à 90 %. Confirmer la réussite de la réaction de couplage en préparant des solutions témoins des stocks de billes couplées pour chaque série, avec une concentration finale de 100 billes par microlitre dans le tampon d’essai, et en préparant une dilution de l’espèce antisérique marquée au FICO érythrine.

Anticorps de confirmation IgG à quatre microgrammes par millilitre dans du tampon de dosage. Aliquoter 50 microlitres de chaque solution test dans quatre puits d'une plaque 96 puits à fond rond, pour un total de 16 puits. Ajouter ensuite 50 microlitres de tampon de dosage dans huit des puits pour mesurer le fond et 50 microlitres d'anticorps de confirmation dilué dans les huit puits restants. Mélanger délicatement les réactions en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas à l’aide d’une pipette multicanal.

Couvrez la plaque et incubez pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur de plaque. Placez la plaque sur un séparateur magnétique pendant une à deux minutes afin d’attirer les billes hors de la solution. Ensuite, éliminez le liquide en retournant énergiquement la plaque, toujours placée sur le séparateur, au-dessus d’un récipient de déchets.

Lavez chaque puits deux fois en ajoutant 100 microlitres de tampon de dosage et en éliminant le SANE de la plaque de la même manière. À l’aide du séparateur magnétique pour plaque, resuspendez les billes dans 100 microlitres de tampon de dosage en pipetant doucement cinq fois de haut en bas avec un pipeteur multicanal. Analysez à l’aide d’un appareil Luminex xap, tel que l’appareil magix.

L'intensité du signal fluorescent de cette réaction est directement proportionnelle à la quantité de protéine à la surface des billes, ce qui permet une évaluation rapide de la quantité relative de protéine couplée aux billes. Pour déterminer la paire d'anticorps la plus efficace dans le test xap, préparez un mélange initial des quatre jeux de billes en ajoutant 10 microlitres de chacun à 0,96 millilitre de tampon de dosage. Préparez les solutions d'anticorps de détection en diluant chaque anticorps à une concentration d'un microgramme par millilitre dans le tampon de dosage.

Aussi un tampon d'essai. Préparez l'étalon protéique TNF alpha des systèmes r et d à 2000 picogrammes par millilitre et diluez la streptavidine R FICO érythrine à huit microgrammes par millilitre. Ajoutez 50 microlitres du mélange de billes couplées à l'anticorps dans chacun des 16 puits d'une plaque 96 puits CoStar à fond rond pour l'essai de criblage.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de tampon de dosage à huit des 16 puits pour mesurer le fond. Puis pipetez 50 microlitres de l'étalon de TNF alpha dans les huit autres puits afin de mesurer la réponse. Incubez pendant une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière, tout en agitant sur un agitateur pour plaque de dosage.

Ensuite, ajouter 50 microlitres de chacun des quatre anticorps de détection à quatre puits, dont deux sont des puits de fond et deux des puits de réponse. Incuber pendant 30 minutes dans les mêmes conditions après l'ajout de 50 microlitres du réactif SAPE dans tous les puits. Incuber à nouveau pendant 15 minutes dans les mêmes conditions.

Placer la plaque sur un séparateur magnétique pendant une minute. Ensuite, éliminer le liquide en retournant vigoureusement la plaque, toujours placée sur le séparateur, au-dessus d'un récipient de déchets. Ajouter 100 microlitres de tampon de dosage dans chacun des 16 puits à l’aide d’une pipette.

Ensuite, retirez le liquide des billes à l'aide d'une séparation magnétique. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon d'essai dans chacun des 16 puits. Lisez la plaque à l'aide de l'instrument Luminex mag picks en vous référant au mode d'emploi pour une utilisation correcte.

Sélectionnez une paire d'anticorps qui répond à l'intensité de signal souhaitée. Après avoir choisi le meilleur anticorps de capture, diluez 100 microlitres de la solution mère d'anticorps couplés à des billes à 10 millilitres avec du tampon d'analyse. Ajoutez 50 microlitres des billes diluées dans 78 puits de deux plaques 96 puits CoStar à fond rond.

Chaque plaque servira à évaluer la performance d'un anticorps de détection différent. Préparez ensuite une courbe standard à 12 points, commençant à 8 000 picogrammes par millilitre et se terminant à quatre picogrammes par millilitre. Avec les systèmes r et d.

Ajouter six réplicats de 50 microlitres de chaque dilution de l'étalon TNF Alpha à chacune des plaques, ainsi que six puits contenant chacun 50 microlitres de tampon de dosage, servant de fond pour un total de 78 puits par plaque. Incuber les plaques pendant une heure à température ambiante, à l'abri de la lumière, tout en agitant sur un agitateur pour plaque de dosage. Ensuite, ajouter 50 microlitres du premier anticorps de détection dans les 78 puits de la première plaque.

Répétez pour le deuxième anticorps de détection sur la deuxième plaque. Incubez les plaques pendant 30 minutes dans les mêmes conditions. Ensuite, ajoutez 50 microlitres du réactif SAPE dans tous les puits de chaque plaque.

Après avoir agité les deux plaques pendant 15 minutes à l'abri de la lumière, placez les plaques sur des séparateurs magnétiques pendant une minute. Éliminez le liquide en retournant brusquement la plaque au-dessus d'un récipient de déchets, tout en la maintenant sur le séparateur. Ensuite, pipetez 100 microlitres de tampon de dosage dans chacun des 78 puits des plaques, avant d'éliminer le liquide des billes magnétiques comme précédemment.

Après avoir ajouté cent microlitres de tampon de dosage sur les billes dans chacun des 78 puits des plaques, analyser les plaques à l’aide de l’instrument mag picks en vous référant au manuel d’utilisation pour le fonctionnement adéquat. Suivre les instructions fournies avec le kit ELISA DUOset TNF Alpha humain T NF SF 1a de R & D Systems. Mesurer la réponse générée par l’étalon fourni avec le kit R & D.

Répétez le test ELIa trois fois supplémentaires en remplaçant les anticorps de capture et de détection des systèmes r et d par les anticorps des autres fournisseurs. Par souci de simplicité, associez les anticorps par fournisseur et évaluez chaque paire indépendamment, comme requis par le format EISA, avec chacun des trois standards protéiques de TNF Alpha. Les tests Luminex Xap ont été réalisés en multiplex afin d'évaluer simultanément les quatre anticorps de capture sous forme de mélange, en combinant quatre jeux d'anticorps anti-TNF alpha couplés à des microsphères Mag PLX ; les anticorps de capture ont été évalués avec chacun des quatre anticorps de détection biotinylés individuellement, de sorte que l'interaction d'un anticorps de détection donné avec chacun des quatre anticorps de capture puisse être déterminée simultanément.

Les résultats ont indiqué que la paire d'anticorps provenant du jeu DUO des systèmes r et d avait donné les meilleurs résultats, avec une réponse atteignant 6 183 unités d'intensité de fluorescence médiane ou MFI. On a également observé que les anticorps de détection de Millipore et ABAM produisaient une réponse raisonnable dans le test XAP lorsqu'ils étaient associés à l'anticorps de capture des systèmes RD, tandis que les anticorps de capture de Millipore, ACAM et Novus produisaient une réponse moins satisfaisante dans le test XAP. Le protocole du jeu DUO des systèmes r et d a été utilisé pour comparer les quatre paires d'anticorps dans un format EISA.

Le protocole des systèmes r et d a été utilisé avec toutes les paires d'anticorps car il reflète les protocoles EIA typiques largement utilisés aujourd'hui, et il est analogue aux protocoles utilisés avec la technologie xap. Les tests EISA ont montré que la paire d'anticorps des systèmes r et d donnait à nouveau les meilleurs résultats. La paire d'anticorps d'Acam n'a produit aucune réponse, et les paires d'anticorps de Millipore et de Novas ont produit des réponses modestes afin d'évaluer toute variation de la réactivité des anticorps.

Avec l'étalon, les quatre paires d'anticorps ont été testées avec trois étalons protéiques recombinants de TNF alpha provenant de trois fournisseurs différents. Les données montrent que les étalons protéiques recombinants de TNF alpha des trois fournisseurs ont donné des résultats équivalents. La protéine TNF alpha des systèmes r et d a été utilisée pour générer des courbes d'étalonnage avec les tests ELSA et XAP.

Bien que le test ELI A ait été réalisé avec la paire d'anticorps du système r et d, les tests Xap ont utilisé l'anticorps de capture du système r et d et, comme anticorps de détection, soit celui des systèmes r et d, soit celui de Millipore. La protéine TNF alpha des systèmes r et d a été diluée pour produire une gamme de concentrations allant de 8 000 à quatre picogrammes par millilitre uniquement. La paire d'anticorps des systèmes r et d a donné le résultat attendu dans le test Xap, avec une réponse supérieure à 20 000 MFI, comme indiqué.

Lorsque l'anticorps de détection de Millipore a été utilisé avec le test Xap à la place de l'anticorps de détection des systèmes r et d, la réponse était d'environ 30 % de celle obtenue avec l'anticorps de détection de RD Systems. La ligne verte sur ce graphique représente la courbe standard de l'ELA, dont la gamme recommandée de TNF alpha par le fabricant était de 16 à 1000 picogrammes par millilitre. En raison de la limite du spectrophotomètre, il n'a pas été possible d'augmenter la gamme du test Eliza.

En outre, la plage dynamique et la sensibilité des deux méthodes sont mieux illustrées lorsqu'elles sont représentées sur une échelle logarithmique. Une distinction nette entre la pente de la réponse EISA et les réponses des tests xap peut être observée, ce qui indique davantage une capacité plus limitée de détection du TNF alpha avec l'EL iza, tant à des concentrations élevées qu'à des concentrations faibles. Les limites de détection, ou LOD, des deux tests fonctionnels xap du TNF alpha ont été estimées en identifiant la concentration la plus faible de TNF alpha produisant un niveau de réponse observé supérieur au bruit de fond, augmenté de trois fois son écart-type (SD) calculé à partir de six réplicats.

Ici, on peut observer que lorsqu'on utilise la paire de systèmes r et d, la concentration la plus faible de TNF alpha, soit 3,91 picogrammes par millilitre, a produit une réponse de 66 MFI, supérieure à la réponse correspondant au fond plus trois écarts-types. Ce critère est ainsi satisfait. Lorsque l'anticorps de détection Millipore a été utilisé avec l'anticorps de capture du système r et d, la limite de détection était inférieure à 7,81 picogrammes par millilitre.

Dans ce cas, la deuxième concentration la plus faible de TNF alpha a produit une réponse acceptable de 17 UFM, supérieure de trois fois l'écart type à la réponse obtenue avec la concentration la plus faible de TNF alpha. De même, la limite de détection pour le jeu double système r et d par Eliza a été estimée entre 63 et 31 picogrammes par millilitre. Suite à cette procédure, d'autres étapes telles que les tests, l'utilisation de différentes matrices d'échantillons ou des concentrations variables d'anticorps dans le système rapporteur peuvent être réalisées afin d'optimiser davantage le test xap.