Analyser l'internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d'imagerie

Pour analyser les mécanismes cellulaires d'internalisation de nanoparticules et de bactéries par cytométrie en flux à imagerie multispectrale. Les macrophages sont d'abord prétraités avec de la cytochalasine D afin d'inhiber la polymérisation de l'actine. Des nanoparticules ou des salmonelles sont ajoutées aux macrophages en monocouche et incubées.

Ensuite, les macrophages sont récoltés, fixés et marqués pour analyse à l’aide d’un flux d’images. Un cytomètre de flux à imagerie multispectrale permet de distinguer les cellules ayant internalisé des nanoparticules ou des salmonelles de celles présentant des nanoparticules ou des salmonelles liées à la surface. Les données obtenues indiquent que les salmonelles et les nanoparticules sont internalisées uniquement par les cellules qui n’ont pas été traitées avec la cyto klaine.

D suggérant que l'internalisation dépend de l'actine. Cette technique présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes telles que la cytométrie en flux et la microscopie confocale. Principalement, elle permet de mesurer avec précision les intensités du signal fluorescent et la résolution spatiale entre différentes caractéristiques cellulaires à grande vitesse.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la recherche sur les vaccins et la délivrance de médicaments à base de biomatériaux, ainsi que dans les études sur les interactions hôte-pathogène. Cela inclut la définition des voies d'internalisation utilisées par les nanoparticules en polyanhydride et par les bactéries. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent souvent des difficultés.

Il est important de consacrer du temps à la titration des colorants afin d'obtenir des signaux de fluorescence optimaux. De plus, la prise en main du logiciel et la création de modèles d'analyse nécessitent également du temps. Nous avons eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons observé que les nanoparticules polyhydro présentent des caractéristiques imitant celles des agents pathogènes lors de l'utilisation de la microscopie et d'autres techniques.

Nous souhaitions ensuite un système à haut débit pour comparer les processus d'internalisation utilisés par Salmonella et les nanoparticules d'hydrure de pollen avant la réalisation du test. Toutes les cultures cellulaires de mammifères et bactériennes doivent être récoltées, et les suspensions de nanoparticules doivent être préparées. Commencez par récolter les cellules RA W2 64.7 confluentes à l’aide d’un racloir à cellules.

Déterminez le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Ensuite, semez les cellules dans une plaque de culture de 24 puits à une densité de cinq fois 10 à la puissance 5 cellules par puits dans 0,5 millilitre. Incubez toute la nuit dans du DMEM complété à 37 degrés Celsius et dans un incubateur avec 5 % de CO2.

Pour préparer la dilution de Salmonella Tarica, transformer Salmonella dans du C-D-M-E-M afin d'obtenir une multiplicité d'infection de cent par cellule RAW 264,7 dans un tube de culture en verre stérilisable par autoclave de 16 × 125 millimètres. Ensuite, à l’aide de papier filtre stérile, peser cinq milligrammes de nanoparticules chargées à 1 % de FITC en anhydride polymère, produites selon la méthode décrite par Rean et collègues dans leur publication de 2009 dans Pharmaceutical Research, dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajouter les nanoparticules à 0,5 millilitre de solution saline tamponnée au phosphate froide, puis placer sur glace.

Garder le tube sur de la glace. Utiliser un homogénéisateur ultrasonique avec une micro-pointe pour soniquer la suspension pendant environ 25 secondes à quatre à six joules. Maintenant que toutes les cellules et réactifs nécessaires sont prêts, le test de phagocytose peut être réalisé.

Étiqueter des plaques de culture tissulaire à 24 puits contenant des cellules RAW 264.7 cultivées en vue du dosage sur la première plaque. Chaque échantillon suivant sera dosé en triplicata : cyto D avec nanoparticules, cyto D avec Salmonella, milieu avec nanoparticules, milieu avec nanoparticules de Salmonella, nanoparticules uniquement, Salmonella uniquement, et cellules marquées uniquement avec AF647 comme témoins à 4 degrés Celsius. Ces derniers seront dosés sur la seconde plaque et comprendront l'incubation du milieu plus nanoparticules et du milieu plus Salmonella à cette température basse, ralentissant les processus cellulaires tels que la phagocytose. Une heure avant l'induction, ajouter 5 microgrammes par millilitre de cyto D et de C-D-M-E-M aux puits appropriés et incuber les cellules à 37 degrés Celsius.

Après l'incubation, vortexer la suspension de nanoparticules et ajouter 10 microlitres dans les puits appropriés. Ensuite, vortexer la salmonelle et l'ajouter dans les puits appropriés à un MOI de 100. Tapoter la plaque plusieurs fois pour mélanger.

Ensuite, placer les plaques d'échantillons à 37 degrés Celsius et les plaques de contrôle négatif à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Après l'incubation, placer les plaques sur de la glace, laver les cellules deux fois avec du PBS glacé sans calcium ni magnésium en aspirant et en éliminant le milieu ancien pour éliminer les particules non liées, les salmonelles, ainsi que les cellules mortes ou détachées. Utilisation de magnésium pétale.

Le pré-lavage au PBS à ce stade est essentiel car il facilite le détachement des cellules du substrat. Pour récolter les cellules, ajouter 250 microlitres de PBS glacé et détacher délicatement les cellules au fond des puits, puis transférer les cellules récoltées dans des tubes microcentrifugeurs coniques siliconés, et les maintenir sur glace. Laver les cellules en ajoutant un millilitre de tampon de lavage froid, puis centrifuger à 250 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir éliminé le surnageant, retirer le tampon résiduel en tapotant le tube microcentrifugeur retourné sur du papier absorbant.

Réamorcer le culot cellulaire en passant délicatement le tube de microcentrifugeuse sur une rangée de tubes à essai. Pour fixer les cellules, ajouter 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS et laisser les cellules en contact pendant 15 minutes. À température ambiante, laver les cellules en ajoutant un millilitre de tampon de perméabilisation et de lavage, puis centrifuger à 250 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir éliminé le surnageant, retirez le tampon résiduel comme précédemment. Ensuite, pour colorer les cellules RAW 264.7, ajoutez 100 microlitres de tampon de perméabilisation/lavage contenant l’Alexa Fluor foid dans six 60 pendant 15 minutes.

À température ambiante, les échantillons non colorés doivent être incubés avec le tampon de perméabilisation et de lavage sans phin. Après la coloration, laver et centrifuger à nouveau les cellules, puis les resuspendre dans 50 microlitres de PBS contenant 1 % PFA et les conserver à l'abri de la lumière à quatre degrés Celsius jusqu'à l'acquisition. Mettre sous tension, démarrer le flux d'images et lancer.

Activez et initialisez la fluidique dans le menu Fichier. Choisissez charger le modèle par défaut. Dans la galerie d'images, sélectionnez tout dans le menu Affichage et appuyez sur Exécuter la configuration pour commencer l'acquisition des images des billes ; si nécessaire, ajustez le suivi du noyau pour centrer les images latéralement.

Sélectionnez le canal champ clair et cliquez sur « définir l'intensité ». Attendez que le coefficient de variation de la vitesse d'écoulement soit régulièrement inférieur à 0,2 %. Dans l'onglet d'assistance, cliquez sur « démarrer tout » pour exécuter les étalonnages et les tests, puis vérifiez que tous ont réussi dans le logiciel. Cliquez sur « charger l'échantillon ».

Ensuite, lorsque vous y êtes invité, placez le flacon contenant l'échantillon le plus brillant. Avec tous les fluorochromes dans le chargeur d'échantillons, sélectionnez un grossissement de 40 x. Une fois les paramètres de l'appareil établis, ne les modifiez pas pendant toute la durée de l'expérience.

Activez chaque laser de l'expérience en cliquant sur les icônes de laser dans le logiciel et réglez la puissance du laser de sorte que chaque fluorochrome présente des valeurs maximales de pixels comprises entre 104 000 comptes, telles que mesurées sur les diagrammes de dispersion. Pour éviter la collecte d'objets indésirables, cliquez sur la fenêtre de classification des cellules dans le logiciel. Ensuite, pour ne collecter que les données cellulaires, sélectionnez le seuil inférieur du canal un pour le champ clair et réglez la valeur à 50 micromètres : les objets dont la surface est inférieure à 50 micromètres seront considérés comme des débris et ne seront pas acquis.

Sélectionnez les canaux à acquérir en cliquant sur les icônes de canal appropriées dans le logiciel ici. Les canaux 1, 2, 3, 4, 5 et 6 sont sélectionnés sous l'onglet configuration. Saisissez le numéro de fichier et le dossier de destination.

Fixez le numéro de séquence à un et le nombre d'événements à acquérir à 5 000. Cliquez sur Démarrer pour collecter et enregistrer le fichier de données de la première expérience. Cliquez sur FLL puis exécutez l'échantillon expérimental suivant.

Répétez jusqu'à ce que tous les échantillons expérimentaux aient été collectés. Ensuite, pour exécuter les témoins, cliquez sur les paramètres de compensation. Cela désactivera le champ clair et le laser de diffusion et permettra la collecte de tous les canaux de fluorescence sous l'onglet acquérir.

Modifiez la valeur d'entrée à 500. Ensuite, placez le tube témoin et cliquez sur « exécuter ». Acquérez afin de recueillir 500 cellules positives dans les témoins simplement marqués.

Répétez pour chaque fluorochrome de l'expérience afin d'élaborer une matrice de compensation. Une fois que toutes les images des échantillons ont été acquises, lancez le logiciel d'analyse ideas sur un ordinateur d'analyse distinct en double-cliquant sur l'icône ideas située sur le bureau. Double-cliquez sur l'assistant d'internalisation et chargez l'un des fichiers RIF de l'échantillon test.

Une fenêtre contextuelle fournira des instructions pour charger les fichiers de test. Suivez les instructions et cliquez sur le bouton suivant. Ensuite, cliquez sur nouvelle matrice.

Cela lancera l'assistant de compensation. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez les fichiers de données pour les contrôles monochromes afin de les ajouter. Cliquez sur « suivant » dans l'assistant en suivant les instructions, jusqu'à ce que le fichier de matrice de compensation soit enregistré et chargé dans la case à l'étape deux de l'assistant d'internalisation.

Cliquez sur suivant et suivez les instructions jusqu'à la génération d'un fichier DAF. Réglez les propriétés d'affichage de l'image en sélectionnant les canaux d'image utilisés lors de l'acquisition. Cliquez sur le canal deux pour FITC et sur le canal cinq pour AF 606.

Le champ clair et la diffusion latérale sont sélectionnés par défaut. Sélectionnez le canal en champ clair O pour délimiter la frontière cellulaire et le canal O2 dans lequel les nanoparticules ou les bactéries ont été détectées afin de définir la sonde d'internalisation et ainsi identifier la population de cellules uniques ; un nuage de points représentant la surface en champ clair en fonction du rapport d'aspect en champ clair de toutes les cellules est alors généré. L'analyse à haut débit de plusieurs fichiers de données nécessite un fichier modèle, il est donc essentiel de définir soigneusement les fenêtres (gates) lors de la création de ce fichier modèle.

Chaque point représente les valeurs d'une image de cellule individuelle. Cliquez sur un point dans un graphique pour sélectionner l'image de cette cellule particulière dans la galerie d'images.

Ensuite, dessinez une fenêtre autour des cellules dont la surface et le rapport d'aspect correspondent à des événements de cellules simples. Les cellules uniques ont un rapport d'aspect d'environ un, tandis que les doublets ont un rapport d'aspect d'environ 0,5.

Cliquez sur plusieurs cellules pour différencier la région contenant des cellules uniques des doublets ou des débris. Pour générer un histogramme de la racine carrée moyenne du gradient en champ clair de l'image en champ clair. Cliquez sur le bouton suivant.

Ensuite, sous l'onglet population, sélectionnez l'option bin pour afficher le bin sélectionné. Cliquez sur les bacs pour déterminer l'emplacement des cellules et le meilleur point de focalisation. Commencez et tracez une région en forme de ligne pour cibler les cellules focalisées.

Plus le RMS du gradient est élevé, plus la mise au point est bonne ; passez alors à l'étape suivante, sauf s'il existe d'autres colorations sur lesquelles effectuer un seuillage. Un nouveau nuage de points représentant l'intensité du canal deux en abscisse par rapport au pixel maximal du canal deux en ordonnée est généré. Cliquez sur les points et visualisez les images afin de déterminer la région à délimiter autour des cellules positives aux nanoparticules ou aux bactéries.

Un histogramme de la caractéristique d'internalisation est généré avec une région commençant à zéro, ce qui doit être ajusté en observant les images. La caractéristique d'internalisation est un rapport entre l'intensité à l'intérieur de la cellule et l'intensité de toute la cellule. Elle est calibrée de sorte qu'une valeur de zéro indique que la moitié de l'intensité se trouve à l'intérieur.

L'assistant a créé une région de chaque cellule qui désigne l'intérieur en générant un masque utilisé, à partir de l'image d'entrée de la cellule, pour localiser la surface cellulaire, puis en réduisant celle-ci de quatre pixels. Notez que ce masque peut être ajusté manuellement pour différents types cellulaires lorsque cela est nécessaire, en créant d'abord un masque d'objet sur l'image en champ clair, puis en l'érodant d'un nombre plus élevé ou plus faible de pixels. La caractéristique d'internalisation est calculée à partir de ce masque d'objet érodé à l'aide d'un algorithme intégré au logiciel.

Cette fonctionnalité nous permet de distinguer les particules et les bactéries internalisées, dont la majeure partie du signal fluorescent se situe à l'intérieur de la limite du masque, des particules et bactéries liées à la surface, dont la majeure partie du signal fluorescent se trouve à l'extérieur de la limite du masque, comme illustré dans cet exemple. Créez un nouvel histogramme avec une nouvelle caractéristique d'internalisation basée sur le masque d'objet érodé. Dessinez une région pour définir un seuil de sélection des cellules internalisées en visualisant l'image dans le mode de bin sélectionné. Réglez le seuil à 0,3. Ici.

Les cellules ayant un score inférieur à 0,3 sont considérées comme des cellules positives liées à la surface. Pour éliminer les cellules présentant un marquage de fond et identifier spécifiquement les nanoparticules ou bactéries internalisées, sélectionnez des caractéristiques dans le menu d'analyse. Cliquez sur le menu d'analyse.

Ensuite, cliquez sur la fonction de comptage des colonies située à côté pour ajouter le nombre moyen de colonies au rapport statistique. Dans le menu des rapports, cliquez sur l'icône des rapports. Puis définissez le rapport statistique, ajoutez des colonnes, puis sélectionnez la population cellulaire appropriée.

Cliquez sur OK. L'assistant d'internalisation ajoutera automatiquement des statistiques à ce rapport afin d'enregistrer le fichier de données comme fichier modèle à utiliser pour l'analyse par lots de tous les fichiers expérimentaux. Cliquez sur le menu fichier et sélectionnez Enregistrer sous modèle.

Fichiers modèles. Ont l'extension dot AST pour analyser plusieurs fichiers de données dans le logiciel IDEA. Cliquez sur Outils et sélectionnez les fichiers de données par lot, puis saisissez tous les fichiers RIF.

Ajoutez le fichier de matrice de compensation et le fichier modèle dans les sections correspondantes pour soumettre le lot au traitement, puis cliquez sur soumettre. Après l'étape de traitement, tous les fichiers RAF sont analysés et des fichiers DAF sont générés pour chacun des fichiers bruts individuels. Un rapport final est produit avec des statistiques pour tous les échantillons afin de comparer l'effet de l'inhibition de l'actine et de la basse température sur la phagocytose des salmonelles et des nanoparticules.

Les cellules RA W2 64.7 ont été incubées à 37 degrés Celsius dans un milieu, avec ou sans cytochaline D, ou incubées dans un milieu à quatre degrés Celsius. À la fois la température et les manipulations de l’actine ont réduit l’internalisation des nanoparticules et de la salmonelle. Toutefois, l’incubation des cellules en présence de cytochaline D augmente le pourcentage de cellules présentant des nanoparticules liées à la surface, tout en diminuant le pourcentage de cellules présentant de la salmonelle liée à la surface.

Le pourcentage de cellules positives pour les nanoparticules liées à la surface augmente d'environ 8 % à 37 degrés Celsius à plus de 35 % après un traitement soit par cyto D, soit à quatre degrés Celsius. En revanche, le pourcentage de cellules présentant des salmonelles liées à la surface a diminué de 35 % à 15 % suite au traitement par cyto D. L'incubation des cellules RAW 264.7 avec Salmonella à quatre degrés Celsius a réduit l'internalisation, sans augmentation apparente de la quantité de bactéries liées à la surface par rapport au témoin à 37 degrés Celsius. Dans leur ensemble, ces données démontrent que Salmonella et les nanoparticules sont internalisées par un processus cellulaire similaire, dépendant de l'actine et de la température.

De plus, les données indiquent que l'attachement prolongé de Salmonella aux macrophages nécessite la polymérisation de l'actine. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser l'internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries par cytométrie en flux d'imagerie multispectrale. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les inhibiteurs sont cytotoxiques.

Par conséquent, des expériences préalables de profilage de la cytotoxicité sont nécessaires pour déterminer les concentrations optimales à utiliser. N'oubliez pas que le travail avec Salmonella peut présenter des risques ; des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle appropriés et l'éviction de la formation d'aérosols, doivent être respectées lors de la réalisation de cette procédure.