Une méthode étape par étape pour la reconstitution d'un transporteur ABC dans des particules lipidiques Nanodisc

L'objectif général de cette procédure est d'incorporer un transporteur de type A, b, C. Dans ce cas précis, il s'agit du transporteur de maltose MalFGK₂ dans des particules nanodiscs membranaires solubles. Cette incorporation est réalisée en mélangeant d'abord la protéine d'échafaudage membranaire MSP avec le transporteur et la quantité appropriée de lipides dans des micelles de détergent.

La deuxième étape consiste à ajouter des billes de polystyrène et à agiter doucement le mélange pendant toute une nuit; le détergent est progressivement absorbé sur les billes, permettant ainsi la formation des particules de nanodisques. Ensuite, les billes sont éliminées par sédimentation. La dernière étape consiste à séparer les disques correctement formés des agrégats et des protéines de structure non assemblées par chromatographie de filtration sur gel.

Enfin, la qualité des disques est évaluée par électrophorèse sur gel natif ou par spectroscopie de diffusion de la lumière. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, comme les liposomes, est que les protéines membranaires et les disques sont parfaitement solubles en solution aqueuse. De plus, les domaines protéiques sont désormais accessibles depuis les deux côtés.

Étant donné qu'il n'y a désormais plus de compartiment membranaire, en utilisant des protéines de soutènement membranaire de longueurs différentes, j'ai pu piéger et étudier les différents états conformationnels des protéines membranaires. Plus important encore, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la protéomique membranaire, telles que l'identification de nouveaux partenaires de liaison des transporteurs a, b, C. En effet, les implications de cette technique s'étendent davantage vers la thérapie, car elle peut faciliter la découverte d'activateurs ou d'inhibiteurs de protéines membranaires et de récepteurs.

Bien que cette méthode semble simple, il convient de faire preuve de prudence lors du choix du rapport protéines/lipides approprié. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés à calculer le bon rapport molaire ou à mettre en place les bons contrôles permettant de garantir la qualité de la préparation. Par conséquent, une démonstration visuelle de cette méthode est très utile pour qu’un étudiant débutant puisse apprendre les différentes étapes et les difficultés potentielles.

Pour commencer, exprimez la MSP marquée par un hexa-histidine dans la souche bactérienne E. coli BL21(DE3) à partir du plasmide pMSSP1D. Induisez la production de protéine lorsque la densité optique mesurée à 600 nanomètres atteint environ 0,5, pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Récoltez les cellules par centrifugation à 5 000 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Resuspendez le culot dans le tampon TSG10 contenant 100 micromolaire de PMSF. Lysez les cellules à l’aide d’un pressoir français, effectué trois fois à 8 000 lb/po² (PSI). Éliminez les matériaux insolubles par centrifugation à 5 000 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, isolez la fraction soluble contenant la MSP par ultracentrifugation à 125 000 g pendant 45 minutes.

Purifiez le MSP par chromatographie d'affinité au nickel en utilisant environ 1,5 millilitre de nickel séros haute performance dans le tampon TSG 10. Éliminez les contaminants avec le tampon TSG 10 contenant 50 millimolaire d'ILE, puis éluerez le MSP avec le tampon TSG 10 contenant 600 millimolaire d'imidazole après dialyse.

La protéine purifiée dans le tampon TSG 10 MSP peut être conservée à moins 70 degrés Celsius et à une concentration en protéine d’environ 10 à 15 milligrammes par millilitre. Le complexe MALF GK deux, portant une étiquette his à l’extrémité C de MAL K, est exprimé à partir d’un plasmide. PED 22 FG K cultivé dans la souche d’E. coli BL 21 DE trois induit la production de protéine lorsque la densité optique mesurée à 600 nanomètres atteint environ 0,5, en présence de 0,2 % L-Arabs pendant trois heures à 37 degrés Celsius, après lyse cellulaire et centrifugation.

Comme précédemment, nous suspendons le culot de membrane dans du tampon TSG 20 jusqu'à une concentration finale de cinq milligrammes par millilitre. Ensuite, nous solubilisons le matériau avec 1 % poids par volume de GDM pendant trois heures à quatre degrés Celsius sous agitation douce. Nous éliminons le matériau insoluble par ultracentrifugation, comme pour la purification de MAL FTK deux.

Ensuite, récupérez le surnageant contenant le complexe mal FTK deux solubilisé et purifiez à nouveau par chromatographie d’affinité au nickel. Purifiez davantage le complexe par chromatographie de filtration sur gel dans le tampon TSGD sur une colonne SUEx 200, HR dix trois cents à un débit de 0,5 millilitre par minute. Pour préparer les phospholipides, un extrait total de lipides d’e coli dissous dans du chloroforme est divisé en 1000 aliquots anormaux dans des tubes microfiches à visser ; évaporez le solvant sous un courant doux d’azote et poursuivez le séchage toute la nuit sous vide.

Séchez ensuite, dissolvez le film lipidique dans du tampon TS à une concentration finale de cinq NMO et vortexez vigoureusement, puis soniquez par impulsions cinq fois pendant environ cinq secondes. Les lipides dissous apparaîtront légèrement opaques en raison de leur insolubilité générale dans le tampon TS aqueux, mais ils doivent rester en suspension. Ajoutez du DDM jusqu'à une concentration finale de 0,5 %. À ce stade, la solution deviendra limpide ; placez le mélange lipidique dans un bain d'eau et soniquez par impulsions cinq fois pendant environ cinq secondes.

Le mélange lipidique peut être conservé à quatre degrés Celsius pendant un maximum d'une semaine. Pour préparer les billes bio, placer environ 10 à 15 millilitres de billes bio dans un tube de 50 millilitres. Premièrement, laver les billes avec 50 millilitres de méthanol à 100 %.

Laisser les billes se déposer par gravité, puis verser doucement la solution. Répéter le processus une fois avec le méthanol, puis deux fois avec de l'éthanol 95 %, de l'eau milli Q et enfin du tampon TS. Commencer la constitution nano-discrète en diluant le MSP dans du tampon TSGD jusqu'à une concentration finale d'environ sept milligrammes par millilitre ou 0,3 millimolaire.

Pour garantir la réussite de l'expérience, il est important de choisir les rapports corrects entre les lipides et les protéines à mélanger. Mélangez environ deux M du complexe purifié malf GK deux à un rapport protéine : MS P : lipide de un : trois : 60 dans du tampon TSGD, pour un volume final de 300 microlitres. Ici, un échantillon avec un excès de lipide, dans un rapport de un : trois : 400, est également préparé comme témoin négatif. Ajoutez 50 microlitres de suspension de bio-perles dans le tube et incubez le mélange toute la nuit sur une table agitée à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, faites sédimenter les perles par gravité. Une fois que les perles ont sedimenté, pipetez la solution à l’aide d’une pipette à embout fin afin d’éviter autant que possible les bio-perles.

Éliminer les grands précipités par ultracentrifugation à 100 000 ×g pendant 20 minutes. Procéder à la purification des disques par chromatographie de filtration sur gel, comme réalisée précédemment dans le tampon TSG 10. Ensuite, injecter un Eloqua sur la même colonne de filtration sur gel pour tester la stabilité de la préparation.

Ensuite, regrouper les fractions contenant les disques. La qualité de la préparation est évaluée par électrophorèse sur gel natif. Analyser un micromolaire de nano-disques pour apprécier la qualité de la reconstitution.

Évaluer également la liaison de mal E au complexe mal ftk deux réconstitué dans des nanodisques. Après l'électrophorèse, colorer le gel avec du bleu de Kumasi pendant 10 minutes et laisser fixer environ une heure. Pour effectuer la diffusion de la lumière dynamique (DLS), purifier d'abord les nanodisques par chromatographie de filtration sur gel comme précédemment, en utilisant une colonne SUEx 200 HR 10/300 à un débit de 0,1 millilitre par minute.

Rassembler les fractions contenant les nanodisques et concentrer à environ 10 milligrammes par millilitre à l’aide d’un filtre centrifuge AmCon. Ensuite, filtrer l’échantillon deux fois. Effectuer l’analyse par DLS en utilisant un instrument Dynapro Nano Star avec une cuvette en quartz d’un volume interne de un microlitre.

À l'aide du logiciel dynamique permettant d'estimer le diamètre et la masse moléculaire des particules, déterminer l'activité A TPAs de deux nano-disques reconstitués mal FTK en utilisant un dosage colorimétrique. Mélanger d'abord un micromolaire de disques purifiés et un millimolaire de A TP avec des quantités croissantes de mal e. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, mesurez le relâchement de phosphate inorganique à 660 nanomètres. Comparez la quantité de phosphate libérée à une courbe standard établie à l’aide d’une solution étalon de phosphore. Les nano-disques sont purifiés par chromatographie de filtration sur gel.

Le chromatogramme montre que la majorité des disques reconstitués éluent sous forme d'un pic unique, tandis que les disques préparés avec un excès de lipides éluent dans le volume mort et sous forme d'une série de pics larges. La qualité de la préparation des disques est ensuite analysée par électrophorèse native : les disques reconstitués avec une quantité limitée de lipides migrent sous forme d'une bande nette sur le gel natif, alors que ceux reconstitués en présence d'un excès de lipides migrent sous forme de traînées. L'analyse par DLS montre que la population de disques est homogène, avec un rayon moyen de 5,0 nanomètres. D'après l'approximation DLS, les disques reconstitués ont un poids moléculaire apparent de 215 kilodaltons. Les échantillons reconstitués en présence d'un excès de lipides présentent des rayons largement distribués autour de 100 nanomètres, ce qui est typique des échantillons non homogènes.

L'activité du complexe MAL FTK deux est évaluée en mesurant la vitesse d'hydrolyse du TP et l'affinité pour des partenaires d'interaction tels que la protéine de liaison au maltose, MAL E, la protéine de liaison au maltose. MAL E se lie avec une forte affinité au transporteur MAL FTK deux en utilisant une électrophorèse sur gel non dénaturant. Il est possible de détecter un complexe entre MAL E et MAL FTK deux ; la stimulation de l'activité MAL KA TPA par MAL E est présentée ici en fonction de la concentration de MAL E.

La fabrication du nanodisque est relativement simple, mais de légères déviations par rapport aux conditions optimales peuvent entraîner une agrégation irréversible des protéines. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux jours. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit l'importance du choix du rapport protéine-lipide adéquat, car un excès de lipides conduira à la production de grandes particules polydisperses, semblables à des liposomes. Il est donc essentiel d'analyser soigneusement la qualité du matériau réconstitué à l'aide de techniques autres que la filtration sur gel, telles que la spectroscopie de diffusion de la lumière, l'ultracentrifugation analytique, ou plus simplement l'électrophorèse native sur gel.

N'oubliez pas que le type de phospholipide intégré dans le disque ainsi que celui de la protéine d'échafaudage membranaire peuvent influencer l'efficacité de la réconstitution. Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous avez acquis une bonne compréhension de la manière de produire des nanodisques solubles et homogènes contenant votre protéine membranaire d'intérêt. Bonne chance dans vos expériences.