Analyse de la méthylation de l'ADN Optimisé et d'expression de gènes à partir de petites zones définies anatomique du cerveau

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la méthylation de l'ADN et les modifications de l'expression génique induites par le stress précoce de la vie. Cette étude est réalisée en soumettant d'abord des souriceaux nouveau-nés à une séparation maternelle afin d'induire un stress précoce de la vie, puis, dans une deuxième étape, en prélevant les régions cérébrales d'intérêt, ici l'APV, par microdissection in loco, et en isolant simultanément l'ADN et l'ARN à partir d'un seul punch de tissu.

Ensuite, l'ADN obtenu est traité au sulfite, et la région d'intérêt est amplifiée par PCR au bisulfite. Ce produit est ensuite ligaturé dans un vecteur et transformé dans des bactéries. Les transformations réussies sont identifiées par l'expression du marqueur et la taille du fragment de PCR.

Enfin, le séquençage au bisulfite est utilisé pour évaluer l'état de méthylation. Le principal avantage de ce protocole est qu'il permet une analyse pratique de la programmation épigénétique en réponse à des stimuli environnementaux. Cette méthode peut fournir des informations sur la programmation épigénétique induite par des adversités précoces.

Il peut également être appliqué à d'autres systèmes. Partout où la méthylation et l'expression génique sont analysées dans un environnement fortement spécifique aux tissus, et partout où la disponibilité des tissus est limitée pour induire un stress précoce de la vie. La séparation maternelle est effectuée sur des souriceaux issus de mères C57BL/6N gestantes à gestation contrôlée afin de provoquer une séparation maternelle.

Transférer chaque portée dans une cage propre chauffée pendant trois heures par jour, du premier au dixième jour après la naissance ; laisser les souriceaux témoins non stressés en paix. À l'exception de la séparation de trois heures, toutes les portées restent avec leur mère jusqu'au sevrage, le 21e jour après la naissance. Ensuite, les souriceaux sont logés par groupes de même sexe, trois à cinq souris par cage, dans des conditions d'élevage standard. Pour commencer la collecte de tissu cérébral, les cerveaux de souris sont extraits des crânes et immédiatement congelés dans de la glace sèche isopentane, puis stockés à moins 80 degrés Celsius.

Lorsque vous êtes prêt à prélever les échantillons tissulaires, retirez les cerveaux du congélateur à moins 80 degrés et placez-les sur de la glace sèche. Commencez par découper les cerveaux en sections coronales de 10 micromètres à l'aide d'un cryostat, de l'avant vers l'arrière. Montez les sections sur des lames en verre super frosts et faites-les sécher pour la coloration au violet de crête.

Des lames supplémentaires peuvent être prélevées et conservées à moins 20 degrés pour des analyses ultérieures, telles qu'une hybridation in situ. Lorsque vous êtes prêt à effectuer les prélèvements, coloriez les lames au violet de crête afin d'identifier les structures cérébrales d'intérêt. Ensuite, à l'aide d'une aiguille de prélèvement, effectuez des prélèvements de 0,8 millimètre des régions d'intérêt par microdissection in loco.

Les prélèvements doivent être conservés à moins 80 degrés Celsius. Il est d'une importance critique que le micro-ponçonnage soit effectué de manière standardisée, car l'expression génique et la méthylation sont fortement spécifiques aux tissus. Homogénéisez les prélèvements dans 400 microlitres de tampon au thiocyanate de guanidinium à l'aide d'une pipette, puis vortexez à température ambiante.

Ensuite, passez le lysat obtenu à travers une seringue de calibre 29. Plusieurs passages doivent rendre le punch invisible. Répartissez le lysat en parts égales.

Un pour traiter l'ARN, qui doit être effectué en premier, et un autre pour traiter l'ADN, qui peut être conservé à température ambiante jusqu'à ce que l'ARN soit traité pour la purification de l'ARN à un volume de dixième d'acétate de sodium, un volume de phénol aqua et un demi-volume de 24 à 1 de chloroforme sur isoamyl AML, en vortexant vigoureusement après chaque ajout. Incuber ensuite le mélange final sur de la glace pendant 10 minutes, puis centrifuger le mélange.

Prélevez la phase aqueuse et ajoutez un volume égal d'éthanol à 70 %. À l'aide d'un kit de colonne de centrifugation pour ARN, effectuez une digestion de l'ADN sur colonne, puis lavez et éluéisez l'ARN dans 25 microlitres d'eau.

À présent, purifiez l'ADN en utilisant un protocole de kit modifié pour inclure une étape de digestion par une RNase, et réchauffez le tampon d'élution et la colonne d'élution à 70 degrés Celsius avant utilisation. Une durée de 10 minutes à 70 degrés Celsius est suffisante pour les colonnes. Enfin, utilisez un spectrophotomètre pour déterminer les concentrations d'ADN et d'ARN.

Un prélèvement typique du noyau paraventriculaire fournit environ 600 nanogrammes d'ADN et environ 400 nanogrammes de RA mis de côté, dont environ 100 nanogrammes d'ARN destinés à l'analyse d'expression génique par PCR quantitative avant amplification par sulfite. Traitez 200 nanogrammes de l'ADN isolé à l'aide d'un kit disponible commercialement afin d'amplifier l'ADN provenant des régions méthylées. Commandez des amorces spécifiquement conçues pour l'ADN converti au bisulfite. Une conception optimale des amorces en PCR bisulfite est essentielle, car la qualité et la spécificité de l'amplicon PCR déterminent la réussite des étapes suivantes.

Lorsque les amorces arrivent, déterminez leur température optimale et de recuit à l'aide d'expériences pilotes. Utilisez deux microlitres d'ADN traité au bisulfite comme matrice pour chaque mélange de PCR de 25 microlitres.

Amplifiez le mélange en commençant par une dénaturation de six minutes à 95 degrés Celsius, suivie de 45 à 50 cycles d'amplification, puis une élongation finale de cinq minutes à 72 degrés Celsius. Analysez sept microlitres du produit de PCR par électrophorèse sur gel Agros afin de vérifier la taille de l'amplicon. Purifiez le produit de PCR restant pour la ligature ultérieure à l'aide d'un kit de purification de PCR disponible dans le commerce.

Si des produits PCR indésirables sont obtenus, utilisez une purification sur gel pour isoler le produit d'intérêt pour ce protocole. Un kit de clonage commercial est utilisé. L'efficacité du clonage dépend de manière critique du fragment inséré.

Ainsi, si un faible nombre de clones recombinants est régulièrement obtenu, essayez un vecteur de clonage différent. Préparez une réaction de ligation de 10 microlitres avec un microlitre de vecteur et trois microlitres de produit PCR purifié. Mélangez la réaction à l’aide d’une pipette et incubez-la toute la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain.

Nettoyer la réaction de ligation par précipitation classique à l'éthanol et transformer les bactéries avec le produit. Ajouter un millilitre de milieu SOB préchauffé directement après l'application de l'impulsion et transférer les bactéries transformées dans un tube réaction. Après une heure de récupération à 37 degrés Celsius, étaler 100 microlitres de chaque suspension sur une boîte de gélose LB contenant de l'ampicilline et enrobée d'IPTG.

Incuber les plaques toute la nuit une fois que les colonies peuvent être prélevées. Préparer des réactions de PCR sur colonie de 25 microlitres dans une plaque de 96 puits en utilisant trois microlitres de chlorure de magnésium 2,5 millimolaire par réaction. Prélever les clones blancs positifs à l’aide d’une pointe de pipette et les transférer dans le mélange de PCR par une simple immersion.

Commencez la PCR par un cycle de fusion de quatre minutes. Suivez par 10 cycles d'amplification avec une température d'appariement de 56 degrés Celsius. Chaque étape de ces cycles dure 30 secondes.

Ensuite, abaisser la température d'hybridation à 48 degrés Celsius pendant 30 cycles supplémentaires d'amplification. Terminer par un cycle d'élongation de cinq minutes. Charger maintenant cinq microlitres de chaque produit sur un gel d'agarose et identifier les réactions contenant l'insert de taille appropriée.

Utilisez un kit disponible dans le commerce pour purifier les produits PCR d'intérêt afin qu'ils puissent être séquencés par séquençage cyclique avec terminateur Big Dye. Dans une plaque de 96 puits, chargez les puits avec trois microlitres de mélange maître de réaction Big Dye, suivis de deux microlitres de produit PCR de colonies purifié. Exécutez la réaction sur un thermocycleur en commençant par une minute à 96 degrés Celsius, suivie de 35 cycles de 10 secondes à 96 degrés Celsius, cinq secondes à 50 degrés Celsius et quatre minutes à 60 degrés Celsius.

Une fois la réaction de bisulfite terminée, purifiez la réaction à l’aide d’une plaque de purification pour réaction de bisulfite. Après avoir obtenu les séquences, analysez-les à l’aide du logiciel en ligne d’analyse de bisulfite ou de l’outil B-I-S-M-A afin de déterminer le profil de méthylation de la région d’ADN étudiée et d’obtenir des informations sur l’influence du stress précoce de la vie ou ELS sur l’expression et l’état de méthylation de la VP. Des souris C57BL/6 ont été traitées selon le protocole décrit ; le noyau paraventriculaire et le noyau supraoptique ont été prélevés pour isoler l’ADN, l’A-D-N-A-R a été traité au bisulfite, amplifié à l’aide d’amorces spécifiques à l’élément enhanceur de la VP, puis les produits de PCR ont été clonés et séquencés, au moins 20 clones recombinants provenant de chaque souris.

Les PCR ont été analysées afin de déterminer les fréquences de méthylation des îlots CpG contenus dans l'amplicon PCR à partir de tissus provenant du P-V-N-E-L-S, qui a induit une hypométhylation significative à quatre emplacements sur l'enhancer de l'AVP, suggérant un marquage épigénétique de cette région régulatrice par des expériences précoces de la vie. Contrairement au PVN, la méthylation de l'enhancer de l'AVP n'a pas été affectée par les ELS dans le SON, illustrant la spécificité tissulaire de l'effet épigénétique. Chez les animaux témoins, le statut de méthylation de l'ADN au niveau du CpG 10 était négativement corrélé à l'expression du gène VP, indiquant un rôle de la méthylation de l'ADN dans l'ajustement fin de l'expression du gène VP. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la UPCR peuvent être facilement réalisées sur l'ARN isolé afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que les modifications de l'expression génique dans le tissu analysé.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier les modifications de la méthylation de l'ADN en réponse à des stimuli dépendants de l'environnement ou de l'expérience.