Polymerase Chain Reaction: Protocole Basic Plus Stratégies de dépannage et d'optimisation

L'objectif général de cette procédure est de démontrer les étapes impliquées dans la réaction en chaîne par polymérase, ou PCR, utilisée pour produire une quantité suffisante d'un segment spécifique d'ADN à partir d'une faible quantité de matériel initial. Tout d'abord, rassemblez les réactifs et les matériaux destinés à être utilisés dans la réaction de PCR, puis préparez une solution réactionnelle contenant les quatre désoxyribonucléotides, le modèle d'ADN, les amorces et la polymérase de l'ADN. Ensuite, programmez les conditions de cyclage thermique et exécutez la réaction de PCR.

À la suite de cela, vérifiez les résultats pour déterminer si la réaction a été couronnée de succès. En fin de compte, une réaction de polymérisation en chaîne devrait produire un amplicon spécifique de la taille souhaitée du produit.

En général, les personnes novices dans ce protocole éprouvent parfois quelques difficultés à établir les calculs pour chacun des réactifs variables, et peuvent également rencontrer des problèmes lors de la pipette, notamment pour les volumes corrects, en particulier avec la polymérase qui contient du glycérol. Commencez l'expérience avec un seau à glace fraîchement rempli. Portez des gants afin d'éviter de contaminer la réaction.

Mélange et réactifs. Placer les composants de la PCR sur de la glace afin de les décongeler complètement. Ceux-ci incluent le brin matrice d'ADN, les amorces, la polymérase de l'ADN, le tampon réactionnel 10 x avec ou sans chlorure de magnésium, les désoxynucléotides, l'eau stérile et le chlorure de magnésium.

Le chlorure de magnésium est nécessaire si l'on utilise un tampon sans chlorure de magnésium. Placer une plaque de 96 puits dans un seau à glace servant de support pour les tubes PCR de 0,2 millilitre à paroi fine. Équiper maintenant le poste de travail avec des tubes PCR et leurs bouchons.

Un porte-tubes PCR, un marqueur résistant à l'éthanol et une série de micropipettes. Établissez toujours un tableau des réactifs détaillant le mélange de réaction avec de l'eau distillée stérile en quantité suffisante pour obtenir un volume final de 50 microlitres. Par exemple, utilisez cinq microlitres d'un tampon sans magnésium, un microlitre de DNTPs à 10 millimolaire et un magnésium optimisé à 4,0 millimolaire.

Un microlitre de chaque amorce à 20 micromolaire, 0,5 microlitre d’un modèle à deux nanogrammes par microlitre et 0,5 microlitre de polymérase nécessiteraient uniquement 33 microlitres d’eau stérile. Ajouter du chlorure de magnésium s’il n’est pas présent dans le tampon 10 x ou s’il est nécessaire pour l’optimisation de la PCR.

Procédez à l'étiquetage des tubes PCR à l'aide d'un marqueur résistant à l'éthanol sur chaque tube de réaction. Ajoutez d'abord les volumes calculés d'eau stérile, puis ajoutez le tampon 10 x et les dNTPs à 10 millimolaire. Pour cette réaction, nous réalisons une titration avec du chlorure de magnésium.

Étant donné que la concentration en magnésium ne sera pas constante, le chlorure de magnésium est ajouté individuellement dans les tubes PCR, et le volume est ajusté à 10 microlitres avec de l'eau stérile, de sorte que 40 microlitres du mélange maître final soient ajoutés à chaque tube PCR. Pour compléter la réaction de 50 microlitres avec le chlorure de magnésium, ajoutez ensuite le modèle d'ADN et les amorces. Enfin, ajoutez 0,5 à 2,5 unités de polymérase ADN par réaction de 50 microlitres dans un tube microfuge de 1,8 millilitre.

Préparez une solution de mélange maître suffisante pour inclure les témoins ainsi que les pertes dues au transfert à la pipette. Réglez une micropipette à environ la moitié du volume total de la solution et mélangez délicatement par aspiration et dispensation. Pour chaque échantillon test, ajoutez le mélange maître dans un tube PCR.

Maintenant, pour le témoin négatif sans ADN matrice, ajoutez tous les réactifs et utilisez de l'eau stérile pour compenser le volume d'ADN manquant. Ensuite, pour le témoin positif, utilisez un jeu d'ADN matrice et d'amorces qui amplifie un fragment connu dans les mêmes conditions que les échantillons expérimentaux de PCR. Les thermocycleurs de PCR chauffent et refroidissent rapidement le mélange réactionnel, permettant la dénaturation thermique des duplex, l'hybridation des amorces aux brins positif et négatif du modèle d'ADN et l'élongation du produit de PCR.

Les durées de cyclage dépendent de la taille du modèle et de la teneur en GC de l'ADN selon la formule générale. Commencez par une dénaturation initiale du modèle, puis initiez de 25 à 35 cycles d'un programme à trois étapes de variation de température. La première étape de ces cycles consiste à dénaturer le modèle d'ADN.

Ensuite, programmez une température optimale, environ cinq degrés Celsius en dessous de la température de fusion apparente des amorces, suivie d'une étape d'élongation permettant à la polymérase de se fixer au brin matrice d'ADN et de synthétiser le produit de PCR. Saisissez maintenant le nombre de cycles. Programmez ensuite.

Une étape d'élongation prolongée pour achever la synthèse des amplicons. Enfin, inclure une étape de terminaison, en refroidissant le mélange à quatre degrés Celsius. Si les conditions standard de PCR ne produisent pas l'amplicon désiré, une optimisation de la PCR est nécessaire pour obtenir de meilleurs résultats.

Donc, si les réactions n'ont pas fonctionné la première fois, vous devez essayer de diagnostiquer le problème. Tout d'abord, vous devez vous assurer que le problème n'était pas dû à une erreur humaine. Cela peut arriver si vous avez commis une erreur de pipetage ou si vous avez oublié d'ajouter un réactif au tube à essai, à l'un des tubes à essai.

Ensuite, vous pouvez essayer de modifier certaines des conditions de stringence afin de changer la configuration du thermocycleur, ou bien vous pouvez modifier la concentration en magnésium, ce qui constitue une autre méthode alternative. Vous pouvez également essayer d'ajouter certains additifs au réactif pour résoudre les problèmes. Une autre option consiste à envisager la PCR en mode « hot start », une modification polyvalente dans laquelle le temps de dénaturation initial est considérablement augmenté.

Une électrophorèse sur gel AROS est ensuite utilisée pour séparer l'amplicon PCR du gène trois GAL à partir de l'ADN génomique de S. seia afin de déterminer la concentration optimale en ions magnésium pour ce jeu de réactifs. Remarquez un produit PCR de la taille attendue : 2098 paires de bases apparaît à partir d'une concentration en magnésium de 2,5 millimolaire, avec une concentration optimale à 4 millimolaires. Sur différents gabarits d'ADN, l'amplification du produit PCR souhaité sous forme d'une bande nette nécessite 2 millimolaires de magnésium. La réduction de la spécificité de la réaction, conduisant à des conditions d'amplification effectivement sous-optimales, produit un smearing de produits non spécifiques.

En outre, grâce à la réduction de la sévérité globale de la réaction, une quantité moindre d'ions magnésium est nécessaire pour former un icône d'amplicon. Ainsi, l'optimisation de la PCR tout en tenant compte des variables permet d'obtenir le produit souhaité de manière spécifique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en place et préparer une réaction en chaîne par polymérase.

L'objectif est de comprendre les variables de chaque PCR et la manière dont elles peuvent être manipulées pour produire l'amplicon souhaité.