Méthodologie d'essai fluorométrique multiplexés dosage immunologique et dépannage

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter des anticorps dirigés contre des agents infectieux adventices chez les animaux de laboratoire. Cela est réalisé en incubant le sérum test avec des microsphères revêtues d'antigène. Ensuite, le sérum est incubé avec une immunoglobuline anti-espèce marquée par la biotine, qui détecte tout complexe immunitaire antigène-anticorps.

Ensuite, une solution de streptavidine marquée FICO érythro Fluor est ajoutée afin de détecter tout résultat d'immunoglobuline biotinylée. Les résultats obtenus indiquent un statut positif ou négatif en anticorps pour les agents courants chez les rongeurs de laboratoire, selon un score net d'immunodosage par fluorescence multiplexe et des valeurs de fluorescence de l'échantillon. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme ELISA, est que MFIA est un dosage multiplexe. Cela permet à un chercheur d'analyser jusqu'à cent dosages différents lors d'un seul test.

Eh bien, cette technique réduit la quantité de sérum et de matériel jetable utilisé dans les méthodes existantes, tout en augmentant la quantité d'informations générées à partir d'un seul test. Nous avons eu pour la première fois l'idée d'utiliser cette méthode lorsque nous testions un grand nombre d'échantillons de sérum pour plusieurs agents et souhaitions réduire la main-d'œuvre ainsi que la durée des tests. La procédure sera démontrée par Donna Cohen, technologue senior de notre laboratoire. Pour commencer, préparez deux tampons nécessaires à la procédure de dosage immuno-enzymatique multiplexe par fluorescence (MFIA).

Le premier est un diluant primaire, disponible chez Charles River et contenant des agents bloquants exclusifs destinés à réduire les interactions non spécifiques dans le tampon de lavage pour le test. Préparez une solution de PBS avec 1 % de BSA à pH 7,4 pour éliminer les particules. Filtrez le tampon à l’aide d’un filtre stérile de 0,2 micron monté sur une bouteille, puis transférez-le dans des récipients stériles étiquetés en utilisant le tampon de lavage pour le test.

Préparez deux concentrations x d'espèces antis biotinylées, IgG ou BAG, ainsi que de streptavidine et de FICOr tout ou SPE, qui seront utilisées pour marquer les complexes antigène-anticorps formés lors de l'étape d'incubation avec le sérum test afin de préparer des échantillons des matériaux suivants et des articles jetables : micropipettes multicanal et monocanal et leurs embouts, ainsi que des plaques microtitration à 96 puits à faible liaison aux protéines pour la dilution des protéines. Après prélèvement des échantillons sanguins et isolement du sérum, vortexez brièvement le sérum avant de diluer les échantillons dans le diluant primaire dans une plaque microtitration à 96 puits afin de garantir un vidage adéquat et uniforme des puits. Pré-humidifiez chaque puits de la plaque test à 96 puits avec le tampon de lavage du test, puis aspirez lentement la solution tout au long du test.

L'aspiration doit prendre de cinq à dix secondes afin de prévenir l'agrégation des billes et leur compactage dans la membrane filtrante, deux phénomènes pouvant ralentir les temps de lecture à la fin du dosage. Vérifiez que l'écoulement du liquide est arrêté en tamponnant la face inférieure de la plaque de test avec des essuie-tout. Il est important de tamponner la plaque de test après chaque étape de lavage afin d'éviter la capillarité hors des puits pendant l'incubation.

Pour préparer les billes, commencez par agiter la suspension de billes couplées en stock à l'aide d'un vortex. Ensuite, soumettez-les brièvement à une sonication en bain. Il est essentiel de bien resuspendre les billes afin d'éviter la formation d'agrégats, qui pourrait entraîner des temps de lecture plus longs.

Ensuite, prélevez la suspension mère 20 x pour obtenir une solution de billes à deux fois la concentration de travail dans le diluant primaire. Puis, ajoutez 50 microlitres de la suspension de billes à deux fois la concentration dans chaque puits d'analyse de la plaque d'essai préhumidifiée. Prélevez à la pipette 50 microlitres de chaque sérum témoin et de test à deux fois la concentration et ajoutez-les dans la plaque d'essai selon un schéma prédéfini de disposition des puits.

Fixer le couvercle sur la plaque. La recouvrir de papier d’aluminium et incuber la plaque de test pendant 60 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante afin d’éviter l’évaporation des solutions, laquelle pourrait compromettre la réussite du test. Garder la plaque de test recouverte de son couvercle durant toutes les étapes d’incubation.

En outre, l'agitation doit être supérieure à 400, mais inférieure à 700 tr/min afin que les billes restent en suspension et permettent aux anticorps sériques d'accéder à toutes les surfaces des antigènes couplés. Après avoir lavé la plaque par des incubations successives des billes avec le BAG et le SPE, laver à nouveau les échantillons. Ensuite, resuspendre les billes en ajoutant 125 microlitres de tampon de lavage pour le test et agiter pendant deux minutes pour lire la plaque.

Placez-le dans le lecteur d'analyse dans les 10 minutes suivant la resuspension des billes ; les billes passent une par une à travers un détecteur où elles sont exposées à deux lasers. Un laser excite les colorants internes qui identifient l'ensemble de couleurs des billes, et l'autre excite le colorant rapporteur FICO érythrine. L'intensité de la fluorescence FICO érythrine pour un nombre prédéterminé de billes est rapportée comme la valeur FM FI. Lisez le premier puits pour vérifier que le panel de billes sélectionné correspond au profil de billes dans les puits de test.

Si des billes tombent en dehors de leur région de billes désignée sur l'affichage du protocole, une sélection incorrecte de profil a été effectuée. Les billes correctement resuspendues rempliront leurs régions spécifiées, tel qu'indiqué dans le logiciel du lecteur d'analyse. Si les billes sont agrégées, elles rempliront leurs régions à un rythme lent.

Vous pouvez retirer la plaque de test du lecteur et resuspendre manuellement les puits pour séparer les billes. Retirez la plaque de test du lecteur et, à l’aide d’une pipette multicanal, aspirez et expulsez chaque puits trois à quatre fois. Replacez ensuite la plaque de test dans le lecteur et poursuivez l’examen des résultats.

Signaler les erreurs telles qu'un nombre insuffisant de billes ou des scores de billes IgG anti IgG faibles, et répéter le dosage pour ces échantillons. Après avoir exporté les données vers Excel et calculé la MFI nette, déterminer si l'un des contrôles du test de dosage est à exclure, à l'exception du sérum immunitaire à concentration élevée. Tout contrôle défaillant est inacceptable et le dosage doit être répété.

Ce tableau représente les données relatives au sérum témoin et aux contrôles de dosage provenant d'une plaque de dosage typique. Tous les contrôles IgG ont-ils été validés ? Les résultats de ce dosage indiquent que de nombreux échantillons réactifs aux tissus et des échantillons contrôles IgG ont échoué, comme indiqué par les puits orange.

A1C un et F1 indiquent un échec de réactivité du tissu TC, le score TC étant indiqué entre parenthèses ; les puits B un et E un illustrent les deux types d'échecs du contrôle interne IgG, à savoir une quantité insuffisante d'anticorps de test ou de réactifs de test, BAG ou SPE respectivement. Les résultats de la plaque de test ne sont interprétés que si le contrôle de validité du système et le contrôle sérique satisfont aux critères d'acceptation indiqués ici. Des microsphères revêtues d'immunoglobulines anti-sérum de test spécifiques à l'espèce peuvent présenter des scores d'échec en raison d'un ajout d'échantillon insuffisant, d'une dilution d'échantillon trop élevée, d'une espèce incorrecte ou de l'utilisation d'un sérum provenant d'un hôte immunodéficient.

Si les résultats du contrôle du test de détection sont satisfaisants, les scores individuels du test sont classés selon ce qui suit. Conformément à cette procédure, nous devrions utiliser des méthodes supplémentaires telles que l'ELISA, l'IFA ou le Western blot pour confirmer les résultats initiaux inattendus ou positifs. Il est essentiel de vérifier ces résultats avant de prendre toute décision concernant la gestion des animaux.

Cela peut être réalisé en utilisant différentes méthodologies sur le même échantillon ou sur des échantillons supplémentaires provenant de la même colonie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer le test immunologique multiplex avec détection fluorométrique et d'interpréter les résultats obtenus dans votre laboratoire. Cela vous permettra de réduire la main-d'œuvre tout en recueillant davantage d'informations à partir de chaque puits d'échantillon testé.