Personnalisation des Aspergillus Niger Morphologie par addition de micro-particules de talc

Cette méthode permet de générer et de caractériser des structures morphologiques dépendantes de microparticules chez le champignon filamenteux *Aspergillus niger*, afin de corréler la morphologie fongique avec la productivité. Cultivez *A. niger* avec ou sans microparticules dans un bioréacteur agité de trois litres pendant 72 heures pour calculer la productivité spécifique. Prélève des échantillons à des intervalles de temps définis et détermine la biomasse, le poids sec et l'activité de la veto-fructo-sase.

Après 72 heures, examiner la morphologie fongique par microscopie et la caractériser par analyse d'image numérique. Ensuite, combiner les paramètres pertinents de l'analyse d'image en un nombre de morphologie qui est corrélé mathématiquement à la productivité spécifique. En définitive, cette méthode permet de générer précisément et de caractériser de façon exhaustive la morphologie d’Aspergillus niger afin de mieux comprendre la morphogenèse des microorganismes filamenteux.

Aspergillus niger est un microorganisme de travail industriel important en biotechnologie depuis plusieurs décennies. L'une des caractéristiques les plus fascinantes et souvent difficiles à maîtriser des aspergillus, de niger et des espèces apparentées est leur morphologie complexe, allant de pellets sphériques denses à des mycéliums visqueux, selon les conditions de culture. Le principal avantage de notre procédé réside dans l'ajout de microparticules, qui nous permet désormais d'ajuster la morphologie fongique spécifiquement aux besoins du procédé.

Jusqu'à présent, aucune autre méthode n'a été décrite pour une personnalisation de cette nature de la morphologie fongique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles concernant la culture de microorganismes filamenteux. En effet, pour une application industrielle, il est crucial de maîtriser la morphologie fongique et également de distinguer une morphologie fongique bien productrice d'une morphologie faiblement productrice.

Notre protocole offre les moyens d'une personnalisation et d'une caractérisation souhaitables de la morphologie fongique. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la morphologie d'Aspergillus niger, elle peut également être appliquée à d'autres micro-organismes filamenteux tels que les souches de Penicillium ou de Strepto. Mettez en place quatre bioréacteurs pour des cultures stériles, comme décrit dans le protocole accompagnant.

Texte basé sur l'ajout de microparticules, cultiver Aspergillus niger avec une morphologie différente. Après 72 heures, transférer 50 millilitres d'échantillons de bouillon de culture dans un tube Falcon.

Des échantillons de biomasse doivent être prélevés au moins en double exemplaire après séchage à l'étuve. À l'aide d'une microbalance, peser un filtre en cellulose. Placer le filtre dans un entonnoir de Büchner muni d'une pompe à vide à jet d'eau, filtrer 10 millilitres d'échantillon, puis 10 millilitres d'eau déionisée afin d'éliminer les composés du milieu de la biomasse. Une fois le filtre plié en deux au milieu.

Placez-le dans une boîte de Pétri en verre et dans un séchoir à compartiments jusqu'à obtention d'une masse constante. Transférez le filtre dans un dessiccateur et laissez-le refroidir. Ensuite, mesurez la masse.

Calculer la masse sèche de biomasse par litre en calculant la différence de poids des filtres, puis en divisant par le volume de l'échantillon, pour les dosages enzymatiques de la glucose oxydase et de la peroxydase. Conserver les échantillons sur glace à l’aide d’une seringue, 1,5 millilitre. Faire passer la suspension de culture à travers un filtre en acétate de cellulose dans un tube à réaction pour effectuer le dosage bêta-fructo SASE.

Soigneusement, nous assurons la réussite avec deux échantillons en triple exemplaire pour une robustesse statistique. Pour démarrer le test, ajoutez 20 microlitres d'échantillon dans le tube à essai ; pour contrôler le clivage du saccharose en glucose, dépendant du pH et de la température, utilisez 20 microlitres d'eau déionisée au lieu de 20 microlitres d'échantillon. En outre, pour chaque échantillon, préparez un témoin négatif destiné à détecter le glucose résiduel dans le bouillon de culture par le test.

20 microlitres d'échantillon inactivé par la chaleur. Pour initier la réaction de conversion du saccharose en glucose, ajouter 200 microlitres de solution de saccharose 1,65 molaire. À pH 5,4, ajouter 20 microlitres d'échantillon et incuber tous les tubes à réaction dans un bloc chauffant à 40 degrés Celsius pendant 20 minutes. Arrêter la réaction en chauffant à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes après avoir refroidi les tubes sur de la glace.

Centrifuger les échantillons si nécessaire, diluer les échantillons pour le dosage de manière à ce que l'absorption mesurée se situe dans la plage de valeurs étalonnées. Pour chaque réaction, ajouter deux microlitres d'échantillon dans une microplaque. Réaliser les mesures des échantillons en triplets.

Préparez également une courbe standard pour 10 solutions de glucose allant de un millimolaire à 15 millimolaires. Pour l'étalonnage du point zéro, utilisez deux microlitres d'eau déionisée. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la solution réactif à chacune.

Incuber correctement pendant 10 minutes à température ambiante. Mesurer l'absorption à 450 nanomètres à l'aide d'un lecteur de microplaques 96 puits Sunrise et du logiciel de récupération de données Magellan. Ouvrir le tableau des résultats avec un tableur et construire une droite d'étalonnage de courbe standard.

Calculez l'activité pour chaque échantillon. Ensuite, calculez l'activité de la bêta-fructofuranosidase en soustrayant les valeurs du témoin négatif approprié de l'activité de l'échantillon. Enfin, calculez la productivité spécifique en tenant compte du poids sec de la biomasse et de l'activité de la bêta-fructofuranosidase.

Placer trois millilitres de suspension de culture dans une boîte de Pétri en plastique et diluer avec une solution physiologique de chlorure de sodium pour séparer les structures morphologiques. La qualité des images microscopiques est d'une importance exceptionnelle. Pour l'analyse d'image ultérieure, une attention particulière doit être portée lors de l'étape de dilution.

Placer la boîte de Pétri sous un microscope équipé d'une caméra intégrée. Acquérir et enregistrer environ 100 images des structures morphologiques par échantillon, en veillant à ce qu'au moins un objet soit entièrement représenté sur chaque image. Poursuivre de la même manière avec les boîtes contenant des échantillons provenant de réacteurs différents, en acquérant de nouvelles images à chaque fois.

Remarquez la forme de croissance morphologique différente des échantillons provenant de réacteurs distincts cultivés avec des quantités variables de poudre de talc ajoutée. Ensuite, ouvrez toutes les images du même échantillon dans le logiciel de traitement d'image Image J. À l'aide de l'outil de traitement, créez une image binaire.

Convertissez les images en noir et blanc afin d'appliquer la commande à une série complète d'images. Utilisez ensuite un code macro, ouvrez l'une des images contenant une barre d'échelle. Tracez une ligne droite traversant la barre d'échelle pour déterminer le nombre de pixels correspondant à 2000 micromètres.

Sélectionnez l'outil d'analyse, définissez la mesure, puis choisissez les facteurs de forme, les paramètres de Feret, le diamètre, la surface et le périmètre. Utilisez un code macro pour traiter une série d'images. Ouvrez maintenant le classeur qui représente graphiquement les résultats des valeurs du facteur de forme.

Pour chaque image, calculez un nombre de morphologie pour chaque image de l'ensemble des images d'un échantillon. Calculez la valeur moyenne du nombre de morphologie. Utilisez un programme de traçage de graphiques et d'analyse de données pour représenter graphiquement le nombre de morphologie en fonction de la productivité spécifique.

Déterminer la relation mathématique par régression mathématique au moyen de l'ajout de concentrations croissantes de microparticules de talc. Huit Niger SKAN 10 15. La morphologie passe d'une morphologie de pellet véritable à une morphologie dispersée, voire mycéliale, car la morphologie de pellet attendue est observée dans des conditions standard.

Curieusement, la morphologie mycélienne est induite par l'ajout au milieu de 10 grammes par litre de microparticules de talc. Parallèlement, l'activité de la Bêta-fructofuranosidase augmente d'environ trois fois ; l'ajout d'un ou trois grammes par litre de poudre de talc conduit à une morphologie dispersée avec une activité fructosique doublée, selon les paramètres déterminés par analyse d'image automatique. La morphologie dépendante des microparticules peut être décrite de manière exhaustive par la morphologie.

La note de nombre, parfaitement ronde sous forme de granulés lisses, apparaîtra en microscopie comme des cercles parfaits pour de telles particules. Le nombre de morphologie a une valeur proche de un dans des conditions standard. La morphologie dans le réacteur un présente un nombre de morphologie d’environ 0,8.

La morphologie dans le réacteur quatre avec 10 grammes par litre. La poudre de talc présente un nombre de morphologie d'environ 0,1. Le nombre de morphologie pour les réacteurs deux et trois, avec des concentrations de poudre de talc de un et trois grammes par litre, se situe entre ces deux extrêmes, démontrant une morphologie dispersée.

Étant donné que la morphologie dépendante des microparticules est étroitement liée à la productivité des bêta-fructosytes, une bonne corrélation mathématique existe entre la morphologie, le nombre et la productivité après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs du domaine de la biotechnologie d'approfondir l'étude de la morphologie fongique, en particulier de sa relation avec la productivité. En suivant cette procédure de création détaillée de types fongiques morphologiques spécifiques, d'autres aspects importants de la culture des microorganismes filamenteux peuvent être explorés.

On sait, par exemple, que la morphologie mycélienne est nettement plus visqueuse que la morphologie en palette. Par conséquent, la productivité globale du procédé est compromise par des problèmes et la purification du produit souhaité. Notre nombre de morphologie aidera à établir des modèles concernant la culture, la prothéologie, et à approfondir notre compréhension générale de la morphologie fongique.