Une plate-forme d'expression pratique et général pour la production de protéines sécrétées à partir de cellules humaines

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure efficace en termes de temps et de coût pour l'expression de protéines sécrétées à partir de cellules HEC 2 9 3 T. Initialement, une culture de cellules HEC 2 9 3 T à 40 % de confluence est préparée dans une plaque à six puits. Un mélange de transfection est ensuite préparé en diluant du GeneJuice, puis les plasmides d'intérêt, dans un milieu sans sérum.

Le mélange de transfection est déposé sur les cellules, qui sont ensuite incubées à 37 degrés Celsius afin de permettre l'expression protéique. La détection de la protéine dans l'agent surnageant peut être réalisée par immunobuvardage. Une fois le vecteur adéquat identifié, le protocole peut être amplifié en utilisant des usines cellulaires à 10 étages.

Les cellules sont transfectées en utilisant le PEI comme réactif de transfection. Les protéines peuvent être récupérées à partir des surnageants de culture par filtration tangentielle suivie d'une chromatographie d'affinité. En fin de compte, cette plateforme permet l'expression d'un large éventail de macromolécules en quantités de l'ordre du milligramme.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'expression dans des cellules d'insectes basée sur le virus balo, est qu'un grand nombre de constructions peuvent être criblées et produites à plus grande échelle pour l'expression, avec des résultats obtenus en seulement trois semaines. La démonstration de cette procédure sera assurée par Hello Aiden pour Shada Zini et Jonathan Cook. Trois étudiants diplômés de mon laboratoire commencent par ensemencer 250 000 cellules HEC 2 9 3 T par puits dans un volume d'un millilitre dans une plaque à six puits, ajoutent un millilitre par puits de DMEM complété avec 10 % de FBS pentre et agitent doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules.

Incuber ensuite les cellules toute la nuit dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules atteignent une confluence d'environ 40 %, remplacer le milieu SUP natum par deux millilitres de milieu frais pour préparer le mélange de transfection. Prélever d'abord 90 microlitres de DMEM sans sérum dans un tube eppendorf.

Ensuite, ajoutez trois microlitres de gene juice, le réactif de transfection, mélangez délicatement le contenu du tube et incubez-le à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite 10 microlitres d'une solution mère à 100 nanogrammes par microlitre du plasmide purifié par mini-prep, l'ADN à transfecter.

Mélangez le contenu du tube et laissez reposer à température ambiante pendant 15 minutes. Pour effectuer la transfection, déposez le mélange sur les cellules HEC 2 9 3 T. Goutte à goutte, agitez doucement la plaque pour répartir uniformément le mélange de transfection.

Ensuite, incuber les cellules à 37 degrés Celsius. Vingt-quatre heures plus tard, ajouter un millilitre de milieu frais dans chaque puits et incuber pendant 48 heures supplémentaires. Trois jours après la transfection, récolter le surnageant et détecter les niveaux d'expression de la protéine d'intérêt par immunobuvardage.

Une fois qu'un construit approprié a été identifié, la procédure de transfection peut être amplifiée. À l'aide de bacs cellulaires en 10 couches, remplir un bac cellulaire avec 1,2 litre de DMEM supplémenté en 5 % de FBS. Ajouter ensuite 200 millions de cellules HEC 2 9 3 T, en répartissant uniformément les cellules sur toutes les couches.

Quatre flacons carrés de 225 centimètres carrés pour culture cellulaire, cultivés à une confluence de 100 %, contiennent environ 200 millions de cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Préparer le mélange de transfection dans un flacon T 75 en diluant 840 microgrammes d'ADN dans 84 millilitres de PBS stérile une fois.

Ajoutez 2,5 millilitres d'une solution d'ions polyéthylène à un milligramme par millilitre, ou PEI, et incubez le mélange à température ambiante pendant 15 minutes. La solution doit devenir trouble. Ensuite, versez lentement le mélange de transfection dans l'usine à cellules et répartissez-le uniformément.

Couches globales. Ajouter l'acide valproïque à une concentration finale de quatre millimolaire. Cela augmentera les rendements d'expression une fois le mélange de transfection ajouté.

Incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant quatre jours afin de permettre l'expression des protéines. Récupérer le milieu quatre jours après la transfection et nettoyer immédiatement l'unité de culture pour la réutiliser ; centrifuger le milieu recueilli à 6 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, puis le filtrer à l’aide d’un appareil de filtration sous vide à capsule stérile de 0,22 micron afin d’éliminer toute matière particulaire. Ensuite, utiliser le système de filtration tangentielle Centra Mate pour concentrer le surnageant à 75 millilitres.

Une fois le surnageant concentré, la protéine d'intérêt peut être purifiée par chromatographie d'affinité. Dans cette expérience, nous avons purifié les sous-unités marquées HA du domaine extracellulaire des récepteurs humains AAL2 en utilisant le système à grande échelle décrit ici, suivi d'une chromatographie avec une affinité élevée contre le THA. Comme illustré par cette analyse SDS-PAGE colorée au Comassie.

Les domaines extracellulaires des sous-unités alpha et gamma du récepteur de l'interleukine deux migrent à des masses moléculaires de 40 kilodaltons et 46 kilodaltons. L'hétérogénéité des glycanes EnLink présents sur IL deux R alpha et IL deux R gamma a provoqué un élargissement des bandes sur le gel SDS-PAGE. La bande de masse moléculaire plus élevée représente une contamination par l'albumine sérique de bovin (BSA).

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment exprimer des protéines à partir de cultures cellulaires humaines en utilisant des usines à cellules à 10 couches. N’oubliez pas que les cellules HC 2 93 T sont considérées comme dangereuses sur le plan biologique et doivent être manipulées au niveau de sécurité biologique 2. Portez toujours des vêtements de protection individuelle appropriés, et les surfaces doivent être désinfectées conformément aux directives institutionnelles et gouvernementales.