La production efficace et purification de recombinant murin Kindlin-3 à partir de cellules d'insectes pour les études biophysiques

L’objectif global des expériences suivantes est de produire efficacement des quantités de milligrammes de Miran Kinlin trois et de cultures cellulaires d’insectes, qui ne peuvent pas être produites chez d’autres hôtes d’expression. Ceci est réalisé par transecteur COT, un vecteur de transfert KINLIN trois associé à un virus bao modifié à l’arrière pour créer un virus bao recombinant portant le gène KINLIN trois. Dans un deuxième temps, le virus est amplifié à l’intérieur des cellules d’insectes pour produire une quantité suffisante de virions pour les étapes futures.

Ensuite, les cellules d’insectes sont infectées pour produire de grandes quantités de protéine Kinlin trois afin de nous permettre de nous purifier par chromatographie liquide rapide. Les résultats obtenus montrent que la kinlin fonctionnelle trois de haute pureté peut être produite en quantités de milligrammes sur la base de l’analyse des pages SDS et de la chromatographie d’exclusion stérique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’expression de l’allumage de trois chez les bactéries est que l’expression des cellules d’insectes infectées par le virus maculaire multiplie par dix le rendement en protéines recombinantes.

Les neuf cellules SF pour cette procédure sont cultivées et maintenues en suspension à l’aide d’un milieu SF 902 complété par 100 microgrammes par millilitre de pénicilline et 100 microgrammes par millilitre de streptomycine. Pour la génération du virus bao, les cellules doivent être cultivées à une plage de densité de cinq fois 10 à cinq à un fois 10 à six cellules par millilitre. Pour préparer les neuf cellules SF pour la transfection, voir environ une fois 10 à six cellules par puits d’une plaque de culture tissulaire stérile à six puits dans deux millilitres de milieu SF 902 complété par de la pénicilline et de la streptomycine, laissez les cellules SF neuf pendant environ 20 minutes à température ambiante dans la hotte pour adhérer à la base des puits en plastique et ainsi former une génération monocouche de virus balo recombinant est obtenue par cot transectant le plasmide, l’ADN et l’ADN BMid sur une culture SF neuf monocouche.

Le vecteur d’expression neurone papine ferme T trois a le gène KINLIN trois de souris ferme T trois. Sous le contrôle du P 10, le promoteur viral BAO possède des séquences virales bao flanquantes pour permettre la recombinaison avec le milieu arrière et code un sifflement terminal C six étiquettes pour la purification en aval pour chaque transfection, produit un à deux microgrammes de MFI T purifié, trois avec 0,5 microgramme de B médian purifié et 100 microlitres de SF 902 SFM sans antibiotiques. Il s’agit de la solution A dans un tube séparé, diluez six microlitres d’effet cellulaire dans deux réactifs avec 100 microlitres de SF 902 SFM sans antibiotiques.

Pour chaque réaction de transfection, un mélange principal peut être créé ici pour réduire la manipulation du liquide si plusieurs transfects sont nécessaires. Il s’agit de la solution B.Mélangez les deux solutions A et B en utilisant environ 200 microlitres de chacune par transfection et incubez à température ambiante pendant 20 minutes pour former des complexes d’ADN lipidique après 20 minutes, diluez les complexes d’ADN lipidique avec 800 microlitres par transfection de SF 902 SFM sans antibiotiques. Ensuite, aspirez soigneusement le support monocouche SF neuf cellules et pipetez soigneusement la solution AB et le mélange de milieu sur le monocouche SF nine.

Incuber les cellules transfectées dans un incubateur humidifié à 27 degrés Celsius pendant la nuit afin de créer un environnement humidifié pour éviter que les cellules ne se dessèchent. Placez le plat à six puits dans un récipient en plastique à côté d’une serviette en papier humide. Le lendemain, ajoutez un millilitre supplémentaire de SF 900 à SFM sans antibiotiques Pour chaque culture monocouche, incubez des cellules à 27 degrés Celsius pendant cinq jours supplémentaires.

Après cinq jours, récoltez le virus bao recombinant directement dans le milieu de culture et transférez-le dans un tube à centrifuger propre. Clarifiez tous les débris de cellules SF neuf par centrifugation à 1000 G pendant cinq minutes. À température ambiante, le transfert du virus, qui est dans les super noms résultants et désigné par P un à un tube propre P une génération de virus, peut être supposé avoir un titre viral attendu de un fois 10 à sept PFU par millilitre.

Bien qu’une SA de plaque puisse être effectuée si nécessaire, stocker le stock viral P un à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à ce que l’utilisation soit utilisée. Les neuf cellules SF utilisées pour l’amplification du virus balo recombinant en suspension doivent avoir une densité de 1,4 fois 10 à six cellules par millilitre et la culture doit occuper un 20e du volume total du ballon. Par exemple, 50 millilitres dans une fiole de deux litres. En général, pour une amplification optimale du virus vao et une production de protéines, les cellules SF neuf doivent être de taille uniforme et sphériques.

Infectez la culture cellulaire SF neuf avec le stock viral P un à une multiplicité d’infection ou MOI de 0,1 en utilisant la formule suivante. Incuber la culture d’insectes infectés par le P one à 27 degrés Celsius en l’agitant à 100 tr/min pendant 72 heures. Trois jours plus tard, récoltez le virus en séparant les cellules du milieu par centrifugation à 1000 G pendant cinq minutes.

Lors du transfert à température ambiante, le virus clarifié enrichit le milieu dans un tube propre. Ce stock viral est noté P deux et le titre viral anticipé est de deux fois 10 à huit PFU par millilitre. Conservez ce stock viral à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il soit utilisé, conservez les pastilles cellulaires résultantes à moins 20 degrés Celsius pour une confirmation ultérieure de la production de virus recombinant.

Pour commencer cette procédure, cultivez un volume adéquat de cultures de cellules SF neuf en suspension et SF 902 s fm. Complété par 100 microgrammes par millilitre de pénicilline et 100 microgrammes par millilitre de streptomycine. Le rapport entre le volume total de culture et le volume du ballon doit être de un à cinq.

Incuber les cultures en suspension à 27 degrés Celsius en les secouant à 100 tr/min jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité cellulaire de deux fois 10 à six cellules par millilitre. Lorsque les cultures SF neuf ont une densité de deux fois 10 à six cellules par millilitre, elles sont prêtes pour l’infection par le virus balo. Compléter les cultures avec une concentration finale de 1 % de sérum fœtal bovin suivi du stock viral P two.

Pour donner un MOI d’un, incubez les cultures infectées à 27 degrés Celsius avec agitation à 100 RPM 72 heures après l’infection, récoltez la polyhistamine recombinante marquée lin three exprimant SF neuf cellules par centrifugation à 1000 GS pendant 20 minutes à température ambiante. Conservez la pastille de cellule obtenue à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’utilisation ou à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Cette procédure commence par la décongélation sur glace.

Les pastilles congelées de SF neuf infectées par le virus vao exprimant la kinline recombinante trois et Resus suspendant les pastilles avec un tampon de lyse. Après avoir incubé les cellules remises en suspension avec le tampon de lyse pendant cinq à 10 minutes, agitez jusqu’à ce qu’une suspension de résine homogène soit obtenue pour une nouvelle perturbation cellulaire. Sonicez l’échantillon dans un bain de glace.

Clarification du lysat par centrifugation à 48 000 GS pendant une heure à quatre degrés Celsius. Chargez les super noms résultants sur une colonne de piège hist de cinq millilitres de volume pré-équilibrée avec un tampon de lyse à quatre degrés Celsius à raison d’un millilitre par minute. Les étapes ultérieures de l’élution protéique, de l’échange de tampon et de la concentration en protéines ne seront pas démontrées ici, mais sont détaillées dans le manuscrit ci-joint.

Une fois la solution de protéine d’échange de tampon obtenue, appliquez-la sur une colonne d’héparine HP pré-équilibrée de cinq millilitres à l’aide d’un FPLC ACTA à un taux de 0,5 millilitre par minute. Le KINLIN trois lié est évoqué à l’aide d’un gradient linéaire de chlorure de sodium dans le même tampon, augmentant à un taux de 10 millimolaires par millilitre de marqueurs d’histamine recombinants. On s’attend à ce que KINLIN 3 élue à environ 0,6 molaire de chlorure de sodium après avoir concentré la protéine, la dernière étape consiste à échanger la protéine tampon à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique, à appliquer la protéine purifiée sur une colonne SUEx S 210 30, à purifier les protéines en fonction de leur taille en appliquant un tampon sur la colonne à un taux de 0,5 millilitre par minute.

La protéine faisant allusion à la colonne est fractionnée et surveillée à l’aide de l’absorbant à 280 nanomètres. Le succès de la génération du virus recombinant a été vérifié en évaluant la présence de cellules recombinantes Kinlin trois et des neuf cellules COT TRANSFECTED SF par page SDS et analyse occidentale comme on le voit dans ce sang occidental représentatif de six cultures SF neuf à petite échelle à l’aide d’un anticorps anti sifflement six, Une bande claire correspondant à une protéine marquée par un sifflement de 75 kilodalton était visible dans chaque échantillon une fois que le virus avait été amplifié et utilisé pour infecter SF neuf cellules dans des expériences à grande échelle. La KINLIN 3 recombinante a été partiellement purifiée par chromatographie d’affinité métallique immobilisée.

L’image principale du gel dans cette figure montre la page SDS de l’affinité du nickel purifié recombinant murin kinlin trois exprimé dans la protéine absorbée par les cellules SF neuf infectées par le virus BAO a été évoquée à l’aide d’un gradient ole montré au-dessus de l’image du gel. MW indique que le marqueur de poids moléculaire LYS est le lysat de la cellule entière, FT est le flux à travers WI est le lavage un et WII est le lavage deux. Une analyse par transfert Western a également été effectuée à l’aide des fractions d’élution pour confirmer la présence de l’étiquette his modifiée sur la protéine recombinante.

Ensuite, le KINLIN three partiellement purifié a été purifié jusqu’à une quasi-homogénéité par chromatographie d’échange d’ions à l’aide d’une colonne d’héparine. Ce panneau montre le profil elucien observé à 280 nanomètres en bleu, affichant un seul pic symétrique éludant sous un gradient linéaire de chlorure de sodium indiqué en vert, en utilisant une plage de concentration de chlorure de sodium de 0,05 molaire à 1,0 molaire. Le panneau du bas montre les résultats de l’analyse de la page SDS de l’élution fractionnée démontrant la présence de la protéine Kinlin trois de 75 kilodaltons.

Comme dernière étape, la pureté de KINLIN three a été polie par chromatographie d’exclusion stérique pour éliminer les agrégats et atteindre l’homogénéité. Ce profil représentatif de filtration sur gel est celui d’un Kinlin trois purifié à l’aide d’un SUEx S 200 en Tris HCL pH 7,5, 150 millimolaires de chlorure de sodium et d’un millimolaire DTT à 20 degrés Celsius. Sur la base du volume d’élution, KINLIN 3 migre comme prévu pour une protéine de 75 kilodaltons, ce qui suggère qu’elle est principalement monomère.

La figure suivante montre les résultats de la page SDS de kinlin trois recombinant purifié hautement concentré marqué K 3 à 14,5 milligrammes par millilitre. La production de quantités millimétriques de kinlin de souris pleine longueur de haute pureté et de culture de cellules d’insectes permettra des études structurales approfondies et une analyse biochimique de la protéine. Un essai de décalage thermique basé sur un plancher thermique a également été effectué dans le cadre de cette étude afin de déterminer quels tampons se stabilisaient pour KINLIN 3.

KINLIN 3 a été dilué dans divers tampons, comprenant un tamis bidimensionnel du pH en fonction de la concentration en chlorure de sodium. Le panneau supérieur est un histogramme 3D des températures de transition et le panneau inférieur montre la variation de la température de transition par rapport à la moyenne calculée de 50,4 degrés Celsius. Les barres sont colorées en fonction de la plage de températures à laquelle elles correspondent.

On a observé que KINLIN 3 était stable à des concentrations élevées de chlorure de sodium dans la plage d’AP de 7,0 à 9,0 avec une température de transition constante de 55 degrés Celsius. On a également observé que la température de transition de Kinlin 3 était d’environ 55 degrés Celsius dans la plage PA de 7,0 à 7,5. Indépendamment de la concentration de chlorure de sodium.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire du bois d’allumage recombinant fonctionnel très pur. Trois pour une caractérisation biophysique approfondie et une étude plus approfondie. Des approches similaires peuvent être utilisées avec d’autres échantillons de protéines difficiles à préparer, et nous recommandons son application dans de tels cas.