Simple mutagenèse bisulfite d'ovocytes

L'objectif général de cette procédure est d'analyser la méthylation de l'ADN dans un seul ovocyte. Cela est réalisé en premier lieu en éliminant les cellules du cumulus et la palita savonneuse des ovocytes recueillis. La deuxième étape consiste à inclure l'ovocyte dans une solution de lyse aros deux pour un afin de protéger la quantité minime d'ADN contre la perte ou la dégradation.

Ensuite, une mutagenèse par bisulfite est réalisée, suivie d'une amplification par réaction en chaîne par polymérase imbriquée. La dernière étape consiste à ligaturer et cloner le produit de PCR. Les clones sont ensuite sélectionnés, amplifiés par PCR et envoyés pour séquençage.

En fin de compte, la mutagénèse par bisulfite et le séquençage sont utilisés pour révéler la méthylation de l'ADN au niveau des dinucléotides cytosine-phosphate-guanine, ou CpG, d'une région d'intérêt dans un seul ovocyte. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la mutagénèse par bisulfite effectuée sur un grand nombre de cellules, est que les données peuvent être obtenues à partir d'un unique ovocyte, sans regroupement, sans biais de PCR ni contamination par des cellules somatiques. Le jour de la collecte des ovocytes, préparez fraîchement les solutions indiquées dans le protocole écrit ; pour réduire les risques de contamination de l'ADN, changez fréquemment de gants, utilisez des pointes filtrantes, maintenez les tubes inclinés lorsqu'ils sont ouverts et refermez systématiquement tous les tubes lorsqu'ils ne sont pas utilisés.

Commencez la collecte des IOS en plaçant les oviductes de souris disséqués dans le milieu M deux et en déchirant la poulie M pour extraire le complexe cellulaire des cellules du cumulus. Ensuite, séparez les cytes du complexe cellulaire du cumulus à l’aide d’une solution d’hyaluronidase à 0,3 milligramme par millilitre dans une goutte de 30 microlitres de milieu M deux. Conservez les cytes en solution uniquement le temps nécessaire à l’élimination des cellules du cumulus, car une exposition prolongée pourrait les endommager.

Lavez les ovocytes dans des gouttes de 30 microlitres de milieu M deux en transférant les ovocytes d'une goutte à l'autre. Éliminez périodiquement les cellules du cumulus pour un total de trois lavages. Retirez la Z de LUCITA à l'aide d'une solution de tyro acide.

Placez d'abord les ovocytes dans une goutte de 30 microlitres de solution, puis transférez-les dans une autre goutte de 30 microlitres. En effet, tout milieu résiduel risque de diluer l'acide et de réduire son efficacité. Maintenez les cytes en solution uniquement le temps nécessaire à l'élimination de la zone, car une exposition prolongée pourrait les endommager.

Après le retrait de la zone, laver à nouveau les cytes dans une goutte de 30 microlitres de milieu M deux pour effectuer l'encapsulation en agarose. Placer d'abord la solution de lyse sur un bloc chauffant à 70 degrés Celsius. Ajouter l'agarose à bas point de fusion, ou LMP Agarose, à la solution de lyse, obtenant ainsi un rapport de deux à un entre l'agarose et la solution de lyse. Ensuite, placer un seul ovocyte sur une lame de verre propre dans un volume minimal de milieu M deux.

L'étape suivante consiste à incorporer le cyte unique dans la solution d'agarose et de lyse. Cette manipulation doit être effectuée rapidement, car l'agarose durcit à des températures inférieures à 65 degrés Celsius. Prélevez 10 microlitres de la solution d'agarose et de lyse à l'aide d'une micropipette sous un microscope.

Expulsez délicatement environ un microlitre ou moins de la solution de lyse agros sur la lame de verre, en laissant le mélange avec le milieu minimal. Ramassez délicatement l'ovocyte dans la pointe de pipette. Ensuite, introduisez les 10 microlitres dans un tube einor contenant 300 microlitres d'huile minérale afin que la gouttelette résultante prenne une forme sphérique.

Incuber le tube sur de la glace pendant 10 minutes pour effectuer la lyse. Retirer les 300 microlitres d'huile minérale et ajouter 500 microlitres du tampon de lyse SDS. Incuber l'échantillon toute la nuit dans un bain-marie réglé à 50 degrés Celsius le deuxième jour.

Préparez les solutions de mutagenèse au sulfure de bihydrogène fraîchement, comme décrit dans le protocole écrit. Commencez la mutagenèse en retirant complètement les 500 microlitres de tampon de lyse SDS. Gardez à l'esprit que tout tampon de lyse résiduel diluera les agros lorsqu'ils seront chauffés, et que la perle sera plus susceptible de se dissoudre lors des étapes suivantes.

Après avoir complètement éliminé le tampon de lyse, ajouter 300 microlitres d'huile minérale. Incuber l'échantillon pendant deux minutes et demie sur un bloc chauffant à 90 degrés Celsius. Prendre garde de ne pas mélanger, agiter, prolonger ou faire varier la température.

Après deux minutes et demie, incuber l'échantillon sur de la glace pendant 10 minutes. Pour effectuer la dénaturation, retirer l'huile minérale et ajouter un millilitre de soude 0,1 molaire au tube, agiter brièvement et retourner le tube cinq à six fois.

Incuber l'échantillon pendant 15 minutes. Dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius, retourner le tube tous les trois à quatre minutes ; la perle doit flotter dans l'hydroxyde de sodium. Remarquer que la perle n'est plus au fond du tube.

Pour réaliser le traitement par sulfite, commencez par centrifuger doucement le tube après avoir retiré l'hydroxyde de sodium. Ajoutez 300 microlitres d'huile minérale et 500 microlitres de solution de sulfite BIS. Veillez à éviter toute exposition à la lumière et incubez le tube pendant trois heures et demie dans un bain d'eau à 50 degrés Celsius.

Effectuez maintenant la désamination. Incubez d'abord l'échantillon sur de la glace pendant trois minutes avant de retirer l'huile minérale et la solution de bisulfite de BIS. Après une courte centrifugation douce, ajoutez un millilitre de solution de soude à 0,3 molaire, secouez brièvement et retournez le tube cinq à six fois.

Incuber l'échantillon pendant 15 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, en inversant chaque trois à quatre minutes. Encore une fois, la bille doit flotter dans l'hydroxyde de sodium avant de commencer la PCR. Laver les échantillons en effectuant d'abord une centrifugation douce.

Ensuite, éliminer l'hydroxyde de sodium et ajouter un millilitre de XTE 1x à pH 7,5. Agiter pendant cinq à dix minutes à température ambiante. Après une deuxième centrifugation douce, éliminer le XTE 1x.

Répétez ce processus de lavage deux fois. Ensuite, ajoutez un millilitre d'eau doublement distillée stérilisée par autoclavage. Agitez pendant cinq à dix minutes à température ambiante, centrifugez doucement pour la troisième fois, puis retirez l'eau.

Répétez le lavage avec de l’eau distillée deux fois. Enfin, éliminez tout le surnageant, en ne laissant que la perle d’aros. Vérifiez que le pH du surnageant est de 5,0.

Si le surnageant est encore trop basique, laver à nouveau les billes avec de l'eau doublement distillée. Pendant ce temps, ajouter le mélange de PCR du premier tour au tube PCR comme décrit dans le protocole écrit. Faire glisser le support solide pour agro vitesse jusqu'au bord du tube einor.

Ensuite, transférez délicatement l'agro vitesse dans le tube PCR et chauffez à 70 degrés Celsius pendant une minute, mélangez, puis effectuez l'amplification comme indiqué dans le protocole écrit. Après l'amplification du premier tour, préparez la réaction PCR du deuxième tour en utilisant cinq microlitres du produit du premier tour comme matrice. Veillez à pipeter sous la couche d'huile minérale.

Procédez à la réalisation du deuxième tour d'amplification comme indiqué dans le texte en tant que test diagnostique. Les échantillons du deuxième tour peuvent être digérés par une enzyme de restriction spécifique de la méthylation ou de la souche, puis les produits de digestion sont séparés par électrophorèse sur un gel d'acrylamide à 8 %. Toute bande hétérogène obtenue représente plus d'une séquence ; pour cloner le produit du deuxième tour, liger dans un vecteur et effectuer un clonage TA comme décrit dans le manuscrit accompagnant cette vidéo. Après le clonage TA, déposez l'intégralité du mélange réactionnel sur une boîte de Petri contenant un milieu gélosé LB additionné d'ampicilline, de X-gal et d'IPTG, puis incubez la boîte à 37 degrés Celsius pendant toute une nuit.

Ensuite, ajoutez le mélange maître de PCR de colonies au tube de PCR comme indiqué dans le protocole écrit. Prélevez une colonie bactérienne blanche sur la plaque à l’aide d’un embout de pipette et mélangez-la par vortex dans 35 microlitres du mélange maître de PCR de colonies dans un tube de PCR. Procédez à l’amplification de la suspension comme décrit dans le texte, puis réalisez une électrophorèse sur gel d’AGAROSE 1,5 % en chargeant quatre microlitres du produit de PCR.

Enfin, envoyer environ 30 microlitres du produit PCR pour le séquençage de cinq PCR de colonies par cyte. Une fois les résultats de séquençage obtenus, les profils de méthylation peuvent être lus : tout cytosine-guanine d'origine qui est restée inchangée était méthylée. Inversement, tout cytosine-guanine d'origine qui est désormais une thymine-guanine n'était pas méthylée après l'amplification par PCR imbriquée à l'aide de primers convertis au bisulfite.

Il est possible de confirmer une conversion réussie en visualisant une taille correcte de fragment sur un gel agarose à partir d'une métaphase individuelle. Deux ovocytes représentent un allèle parental et ont, en théorie, un motif de méthylation empreint. À ce titre, les produits de la deuxième PCR peuvent être testés afin de détecter une contamination involontaire.

Une enzyme de restriction sensible à la méthylation de l'ADN peut être utilisée pour digérer le produit de la deuxième PCR afin d'évaluer s'il contient un allèle méthylé ou non méthylé. Ici, une cytosine méthylée au sein de la séquence de reconnaissance de l'enzyme est coupée. En revanche, une cytosine non méthylée, convertie en thymine, n'est plus reconnue par l'enzyme et reste intacte. Tout échantillon d'ovocyte en métaphase II contenant à la fois des allèles méthylés et non méthylés doit être écarté, car cela indique une contamination par des cellules du cumulus ou l'inclusion d'un globule polaire, après ligation et transformation.

L'amplification réussie par PCR de colonies peut être visualisée sur un gel AROS afin de s'assurer que les échantillons présentant la taille correcte du produit sont envoyés pour séquençage. Dans cet exemple, la taille attendue de l'amplicon après ligation est de cent cinquante-six paires de bases. Ici, le clone cinq présente une taille d'amplicon incorrecte et ne doit pas être envoyé pour séquençage.

La séquence de cinq clones individuels provenant d'un ovocyte en métaphase II devrait produire cinq profils de méthylation identiques et des taux de conversion non CPG identiques. Tout échantillon contenant plus d'un profil doit être écarté. Étant donné que les cytes en métaphase II ovulés possèdent deux copies chromosomiques ou un globule polaire attaché, il est possible d'obtenir deux profils de séquence similaires.

Les données doivent être écartées pour les cellules présentant des profils de méthylation très différents. Étant donné que l'on ne peut pas exclure une contamination par des cellules du cumulus lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir, premièrement, de laver plusieurs fois les ovocytes dans un milieu frais après le traitement HI IDE afin d'éliminer un nombre maximal de cellules du cumulus. Deuxièmement, l'agarose à point de fusion basse durcit à des températures inférieures à 65 degrés Celsius, il faut donc travailler avec soin mais rapidement.

Enfin, le bisulfate de sodium et l'hydroquinone sont sensibles à la lumière, il faut donc envelopper les tubes à réaction et les solutions dans du papier d'aluminium.