D'enregistrement optique de l'activité neuronale supraliminaire avec une résolution à cellule unique et un seul pic

L'objectif général de l'expérience FollowMe est d'enregistrer l'activité de décharge neuronale provenant d'un grand nombre de neurones. Cela est réalisé en observant l'augmentation de la concentration calcique intracellulaire dans le soma d'un neurone associée à chaque potentiel d'action, à l'aide de la microscopie de fluorescence dans une première étape. Une excitation à deux photons et un principe de balayage à accès aléatoire sont utilisés pour enregistrer les signaux fluorescents calciques provenant de 40 somas neuronaux avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Dans la deuxième étape, les instants précis des potentiels d'action sont extraits des signaux fluorescents à l'aide d'un algorithme de déconvolution. Cette technique peut être utilisée pour enregistrer l'activité de décharge de dizaines de neurones. Les données de décharge peuvent ensuite être utilisées pour mesurer l'information mutuelle, la propagation du signal entre des populations neuronales ou les corrélations neuro.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les enregistrements à l'aide d'électrodes microscopiques est qu'elle permet d'enregistrer l'activité de décharge de neurones provenant d'un grand nombre de neurones appartenant à une population locale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles concernant la fonction corticale au niveau des réseaux locaux de neurones, comme l'importance des corrélations dans la recherche d'informations et les modifications de la dynamique des réseaux liées à la plasticité corticale. Pour l'excitation à deux photons, on utilise un système laser à impulsions infrarouges avec des impulsions femtosecondes. Une puissance élevée du laser est nécessaire pour compenser les importantes pertes introduites par les composants optiques du système.

Un précompensateur par système, composé de deux prismes, applique une dispersion de vitesse de groupe négative aux impulsions laser avant les déflecteurs optiques personnalisés, afin de compenser la dispersion temporelle introduite par les AOD. Deux AOD dotés de grandes ouvertures dévient le faisceau laser dans deux dimensions. Un réseau de diffraction réfléchissant présentant 100 sillons par millimètre est placé à 13 centimètres derrière les AOD pour compenser la dispersion spatiale introduite par ceux-ci. Lorsqu'on utilise des impulsions laser courtes, le faisceau laser est dirigé, à l'aide de deux télescopes de relais, vers la sortie caméra d'un microscope droit.

Des diaphragmes sont placés à des intervalles réguliers pour l'alignement des composants optiques. Un séparateur de faisceau dichroïque situé devant l'objectif transmet la lumière d'excitation infrarouge vers l'échantillon et réfléchit la lumière de fluorescence provenant de l'échantillon vers un détecteur. Les détecteurs de fluorescence épi et trans collectent le signal de fluorescence à travers l'objectif et le condenseur ; des filtres en verre coloré sont placés devant les détecteurs afin d'empêcher la lumière d'excitation d'atteindre ces derniers.

Les angles de déviation du déflecteur acousto-optique sont contrôlés par un ordinateur équipé d'une carte convertisseur numérique-analogique, qui commande à son tour des oscillateurs contrôlés en tension. Le signal provenant des photomultiplicateurs est transmis à travers un filtre passe-bas de Butterworth avec une fréquence de coupure de 100 kilohertz et est numérisé par un convertisseur analogique-numérique à une fréquence d'horloge de 156,25 kilohertz avant d'être stocké sur un ordinateur pour analyse. L'alignement et le bruit électrique sont vérifiés en enregistrant la distribution des signaux fluorescents avec et sans lumière laser, à faible et forte amplification des photomultiplicateurs, ainsi qu'avec et sans indicateur. La numérisation aléatoire avec balayage dithered repose sur la détection des augmentations intracellulaires de calcium. La première étape du protocole consiste à marquer un grand nombre de neurones avec la forme ester d'un indicateur de calcium par injection en bolus.

Ensuite, enregistrez l'activité du soma de chaque neurone à quatre emplacements pendant 6,4 microsecondes à chaque emplacement. Pour sélectionner les neurones d'intérêt, acquérez une image complète composée de 256 sur 256 pixels. Puis, sélectionnez manuellement les centres des neurones à enregistrer sur cette image.

Trois points situés à une distance de deux microns autour de chaque centre sont automatiquement ajoutés par le logiciel de contrôle à chaque cycle. Le signal fluorescent est enregistré à partir des quatre emplacements dans l'ensemble des 40 neurones. L'enregistrement provenant de tous les neurones dans un cycle nécessite 1,536 milliseconde.

Répétez cet enregistrement séquentiel des 40 neurones pendant cinq secondes. La détection des potentiels d'action à partir des signaux calciques somatiques fluorescents repose sur un rapport signal sur bruit élevé. Un rapport signal sur bruit élevé peut être obtenu en augmentant l'intensité d'excitation.

Cependant, l'intensité d'excitation ne peut être augmentée qu'à une certaine limite en raison des dommages photo-induits. Il existe une fenêtre très étroite d'intensité d'excitation où les dommages photo-induits sont faibles et le rapport signal sur bruit est suffisant pour détecter des potentiels d'action isolés, afin de garantir que les signaux enregistrés se situent dans la plage optimale de détection des potentiels d'action. Pendant une expérience, plusieurs logiciels d'analyse en ligne développés par notre laboratoire sont utilisés.

Ensuite, calculez le taux approximatif de photons par neurone à partir d'une courte fenêtre temporelle de bruit de fond d'environ 100 à 200 millisecondes. Le nombre de photons et le taux de photons sont calculés à partir des valeurs de fluorescence en ajustant la distribution des variations relatives de fluorescence avec cette équation, puis calculez la fluorescence de base à partir de la même fenêtre temporelle et représentez-la en fonction du temps ou des essais. Maintenez la diminution moyenne de la fluorescence de base en dessous de 0,0002 par seconde en ajustant la puissance du laser.

Car la détection des potentiels d'action diminue rapidement en dépassant cette limite. Ensuite, vérifiez les positions somatiques des neurones toutes les 10 à 20 minutes en acquérant une image en cadre complet. Ajustez les emplacements d'enregistrement si nécessaire.

Les signaux fluorescents résultant de l'activité neuronale sont souvent étalés dans le temps en raison de la longue décroissance du transitoire calcique. Dans cette procédure, une méthode de déconvolution est utilisée pour extraire les potentiels d'action et leurs instants d'apparition à partir des signaux fluorescents. Ici, nous utilisons un algorithme génétique afin de déterminer le modèle de train de potentiels d'action le plus probable qui s'ajuste au signal fluorescent enregistré.

À chaque itération de l'algorithme, la vraisemblance maximale tend asymptotiquement vers sa valeur maximale, déterminée par le bruit des enregistrements de fluorescence. Dans les populations neuronales hétérogènes, le signal calcique induit par un potentiel d'action peut varier d'un neurone à l'autre. Pour l'analyse non supervisée de grands ensembles de données, nous avons conçu un algorithme qui tient compte de la variabilité du signal calcique induit par un potentiel d'action d'un neurone à l'autre, afin d'éviter un grand nombre de détections faussement positives.

La distribution conjointe de l'amplitude et de la constante de décroissance du transitoire calcique induit par un unique potentiel d'action est enregistrée dans un ensemble d'expériences distinct, portant sur le même type de neurones et dans les mêmes conditions expérimentales. Afin de prendre en compte les lents changements de la ligne de base et de réduire les coûts computationnels de la déconvolution, les enregistrements plus longs sont divisés en plusieurs traces plus courtes d'une à cinq secondes pour chaque neurone dans chaque enregistrement. L'algorithme de déconvolution peut tester un grand nombre de modèles, jusqu'à 1 million de modèles différents ou plus. Pour accélérer la déconvolution, une expérience est déconvoluée sur jusqu'à 10 ordinateurs différents en parallèle.

Après la déconvolution, les données de pics sont analysées et inspectées. La probabilité de pic dans l'histogramme péri-stimulus et la fréquence de décharge du neurone sont calculées de manière automatisée. Voici des exemples d'un signal fluorescent enregistré à un taux d'excitation très faible et d'un autre à un taux d'excitation très élevé dans la fenêtre de détection.

Remarquez que chaque exemple montre la réponse à un unique potentiel d'action. On voit ici une microphotographie d'une coupe cérébrale aiguë et deux pipettes de stimulation placées dans la même colonne corticale. Dans la couche IV, on observe les réponses neuronales aux stimuli répétitifs, et ce graphique illustre l'information mutuelle de Shannon transmise par la population neuronale enregistrée.

Voici la mesure de la propagation de l'activité de décharge de potentiels d'action supraliminaire entre différentes populations de neurones corticaux. Il s'agit des potentiels d'action détectés dans les neurones corticaux, en réponse à une stimulation électrique des fibres thalamocorticales. Lors de l'enregistrement de l'activité neuronale à l'aide d'un balayage à accès aléatoire, il est très important d'enregistrer dans la fenêtre de détection.

Sinon, il est très facile de se retrouver avec des ensembles de données inutilisables. La détection optique des potentiels d'action en est encore à ses débuts. Il reste beaucoup de marge de progression.

Avec certaines améliorations, nous enregistrons un nombre encore plus élevé de neurones. Grâce à d'autres améliorations, nous serons même en mesure d'effectuer des enregistrements chez des animaux éveillés et en comportement.