Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry

L'objectif de cette procédure est de mesurer le transport rétrograde de la dopamine dans un neurone soumis à un clampage de tension, en utilisant simultanément un enregistrement en patch clamp et la pyrométrie pour quantifier la libération de dopamine (D) médiée par le transporteur DAT. Cette mesure est réalisée en premier lieu en testant l'intégrité de l'électrode pyrométrique à l'aide de dopamine. La deuxième étape consiste à positionner l'électrode pyrométrique près de la cellule et à établir un enregistrement en mode cellule entière du neurone à l'aide d'une pipette de patch.

Ensuite, la tension de la cellule est contrôlée à l’aide de la micropipette de patch et la dopamine libérée par la cellule via le DAT est enregistrée simultanément à l’aide d’une électrode pyrométrique. La dernière étape consiste à ajouter un inhibiteur du DAT et à enregistrer à nouveau les courants de la cellule entière et les courants pyrométriques, afin de pouvoir soustraire le courant spécifiquement médié par le transporteur de dopamine. L’importance de cette technique réside dans la capacité de mesurer le transport inverse de la dopamine par l’intermédiaire du transporteur de dopamine tout en contrôlant simultanément la tension du neurone dopaminergique.

Le système d'enregistrement simultané de la méthode de patch clamp et de la barométrie nécessite un microscope inversé doté d'optiques DIC de haute qualité et d'un objectif à longue distance de travail afin de générer une source lumineuse continue pour le système. Grâce à un faible bruit électrique, reliez le phare du microscope à une batterie de voiture. Des micromanipulateurs hydrauliques sont utilisés car ils n'ajoutent pas de manière significative aux niveaux de bruit dans notre configuration.

Un manipulateur droitier est utilisé pour le blocage de tension, l'enregistrement en mode cellule entière, et un manipulateur gaucher pour la pyrométrie. Pour préparer l'électrode destinée à l'enregistrement en mode cellule entière, tirez une pipette en quartz à l'aide d'un tireur P 2000. Généralement, nous utilisons une pipette ayant une résistance de trois à quatre mégohms.

Ensuite, remplissez l'électrode avec la solution de micropipette contenant un millimolaire de dopamine. Puis, fixez-la sur le porte-pipette du manipulateur droit. Assurez-vous d'envelopper le récipient contenant la solution de micropipette à la dopamine avec du papier d'aluminium et de le garder sur de la glace lorsqu'il n'est pas utilisé.

Étant donné que la dopamine est oxydable, il est conseillé de garder la solution sur de la glace et à l’abri de la lumière afin de réduire la vitesse d’oxydation. Passez le fil d’argent dans le porte-électrode, puis vissez l’adaptateur paramétrique am sur le porte-électrode. Ensuite, remplissez l’électrode à trois voies avec suffisamment de mercure pour qu’il entre en contact avec le fil d’argent.

Lorsque l'électrode est fixée à l'adaptateur, veillez à examiner au microscope la fibre de carbone pro CFE à faible bruit et l'électrode paramétrique afin de vous assurer que la pointe est propre et intacte. Veillez à tenir l'extrémité opposée de la fibre de carbone pour protéger la pointe de la fibre de carbone contre tout dommage. Ensuite, fixez l'électrode Tric pro CFE.

Montez ensuite l'électrode assemblée sur le manipulateur hydraulique gauche afin d'examiner l'intégrité de l'électrode tric. Abaissez-la dans une boîte de Pétri à fond en verre contenant la solution externe. Enregistrez le courant de base en l'absence de dopamine.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres d'une solution de dopamine à un millimolaire dans la boîte. Une bonne électrode ampérométrique doit enregistrer une augmentation du courant d'oxydation. Veillez à vérifier l'intégrité de l'électrode ampérométrique avant et après les expériences.

Dans cette procédure, récupérez les neurones dopaminergiques ou les cellules modifiées pour exprimer le transporteur de la dopamine, placés dans la boîte de Pétri à fond en verre, à partir de l'incubateur. Lavez délicatement les cellules ou les neurones dopaminergiques trois fois avec une solution externe tiède. Pour visualiser les cellules et réaliser l'expérience, fixez la boîte de Pétri à fond en verre sur la platine du microscope et trouvez le plan de focalisation approprié afin de visualiser clairement les cellules.

Ensuite, appliquez une pression positive à l'électrode de patch. À l'aide d'une seringue de un millilitre, abaissez doucement les deux électrodes dans la solution et rapprochez-les de la cellule à l’aide des micromanipulateurs. Positionnez ensuite l'électrode métrique à gauche de la cellule et l'électrode de patch à droite.

Lorsque l'électrode de patch touche la cellule, appliquez une aspiration légère à l'aide de la bouche ou d'une seringue pour former un scellé giga sur la cellule. Ensuite, rompez le scellé par aspiration afin d'obtenir une configuration en mode « cellule entière », puis laissez cinq à huit minutes pour la dialyse de la solution interne contenant la dopamine dans la cellule.

Ensuite, enregistrer les courants médiés par DAT en faisant varier le voltage de la membrane cellulaire entre moins 60 et plus 100 millivolts à partir d'un potentiel de maintien de moins 40 millivolts via la pipette. Pour déterminer le flux spécifique de dopamine médié par DAT, enregistrer les courants électrométriques en l'absence et en présence d'un antagoniste de DAT. Le courant triphasique spécifique médié par DAT est alors déterminé en soustrayant les tracés enregistrés en présence de l'antagoniste de DAT des tracés électrométriques enregistrés sans l'antagoniste.

Une déflexion vers le haut des courants triphasiques correspond à un flux sortant de dopamine illustré ici. Des courants médiés par le DAT enregistrés en faisant varier la tension membranaire par paliers de 20 millivolts entre moins 60 et plus 100 millivolts à partir d'un potentiel de maintien de moins 40 millivolts, avec une pipette contenant 2 millimolaires de dopamine en mode de patch en configuration whole cell. Voici le courant métrique Emper enregistré simultanément avec le courant whole cell.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer le transport inverse de la dopamine via le transporteur de la dopamine dans un neurone soumis à un blocage de tension. N'oubliez pas de vérifier l'intégrité de l'électrode paramétrique avant et après les expériences, et pensez à soustraire les tracés enregistrés en présence de l'antagoniste des tracés enregistrés en l'absence de cet antagoniste.