Les îlots de rongeurs évaluation de la réplication et la fonction des cellules bêta dans Adenovirally transduites isolées

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les voies de signalisation qui régulent les modifications de la masse fonctionnelle des cellules bêta. Cette approche est réalisée sur des îlots de rat isolés en surexprimant ou en supprimant l'expression d'un gène à l'aide de vecteurs adénoviraux. Après cette manipulation, la fonction des cellules bêta est évaluée par la sécrétion d'insuline, et la réplication des îlots est mesurée par l'incorporation de thymidine tritiée.

En fin de compte, ces tests permettent de déterminer si un gène d'intérêt régule la prolifération et/ou la fonction des cellules bêta in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des paupières, comme de savoir si un composant particulier d'une voie de signalisation influence la croissance et la fonction des cellules bêta. Préparez une plaque de six puits non revêtue pour culture tissulaire en ajoutant deux millilitres de milieu modifié au nombre requis de puits.

Par exemple, une expérience typique peut nécessiter trois puits, un pour un témoin sans virus, un pour un témoin avec virus et un pour le groupe expérimental. Réchauffez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins 30 minutes. Immédiatement après l'isolement des œillets de rat, placez un à 200 œillets dans chacun des puits de la plaque préparée. Soixante œillets seront utilisés pour les dosages biochimiques et les œillets restants peuvent être utilisés pour des études d'expression génique ou pour le transfert immuno-enzymatique. Agitez doucement la plaque afin de centrer les œillets dans chaque puit.

Ensuite, pipetez immédiatement l'adénovirus directement sur les orifices, au centre de la boîte. Utilisez une multiplicité d'infection allant de un à 500, selon l'efficacité de l'adénovirus à surexprimer ou à inhiber votre protéine d'intérêt.

Une pénétration adéquate du virus adénoviral jusqu'au centre de la paupière augmente la reproductibilité des résultats. Il est essentiel de transduire les paupières immédiatement après leur isolement.

Ne pas perturber la plaque pendant cinq minutes, puis la transférer dans l'incubateur pendant 24 heures. Le lendemain, retirer la plaque de l'incubateur et gonfler délicatement les embouts vers le centre des puits. Transférer les embouts dans un nouveau puit contenant du milieu frais à l’aide d’une micropipette de 200 microlitres.

Si les œillets adhèrent à la plaque, ils peuvent être délicatement détachés à l’aide de la pointe de pipette. Il est utile d’utiliser un virus témoin exprimant la GFP afin de vérifier une efficacité de transduction adéquate, en visualisant par microscopie confocale la pénétration de l’adénovirus dans la culture du noyau des îlots. Conserver les îlots pendant un à trois jours supplémentaires, en changeant le milieu chaque jour.

La durée de culture doit être optimisée par des études pilotes et varie selon les objectifs expérimentaux. Pour les dernières 24 heures, ajouter de la thymidine tritiée dans le milieu à une concentration d'un microcurie par millilitre de milieu. Préparer d'abord 50 millilitres du SAB de travail fraîchement dans un tube conique de 50 millilitres et les réchauffer dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Prélvez 10 millilitres de SAB actif dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez 66,8 microlitres de D-glucose 2,5 M. Pour préparer le SAB à forte concentration de glucose, ajoutez 44,8 microlitres de D-glucose 2,5 M aux 40 millilitres restants de SAB actif. Pour préparer le SAB à faible concentration de glucose, étiquetez ensuite trois tubes de microcentrifugation de 1,7 millilitre.

Pour chaque puits de la plaque à six puits, ajouter un millilitre de PBS dans chaque tube. Ne pas oublier de suivre les protocoles institutionnels concernant la manipulation et l'élimination des boutons radioactifs. À l’aide d’un stéréoscope ou d’un microscope standard, sélectionner et transférer 20 boutons de taille comparable dans chaque tube de microcentrifugation.

Par exemple, chaque tube peut contenir cinq œillets de petite taille, dix de taille moyenne et cinq de grande taille. Bien que les résultats soient normalisés par rapport à la teneur totale en protéines à la fin de l'expérience, il est essentiel d'apparier la taille des œillets entre les groupes. Après avoir laissé les œillets se déposer au fond du tube par gravité ou par centrifugation, aspirez le PBS à l’aide d’une micropipette, pesez-le, puis procédez à la préparation des œillets pour les dosages biochimiques.

Pour préparer les puits destinés au dosage de la sécrétion d'insuline, ils doivent d'abord être préincubés avec du SAB à faible teneur en glucose. Pour ce faire, ajoutez 400 microlitres de SAB à faible teneur en glucose dans les tubes et placez-les, bouchés, dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 60 minutes. Après une heure, aspirez le SAB à faible teneur en glucose utilisé pour la préincubation afin de mesurer la sécrétion basale d'insuline. Répétez la procédure de préincubation.

Toutefois, pour mesurer la sécrétion stimulée d'insuline, utilisez 400 microlitres de SAB à haute teneur en glucose au lieu de SAB à faible teneur en glucose et, comme précédemment, incubez les inserts pendant 60 minutes. Après l'incubation, soit en présence de SAB à haute soit à faible teneur en glucose, aspirez le SAB destiné au dosage radio-immunologique de l'insuline, qui sera effectué conformément au protocole du fabricant. Ensuite, poursuivez avec le test d'incorporation de la thymidine en utilisant le même lot d'inserts. Commencez avec les inserts venant d'être utilisés pour le test de sécrétion d'insuline.

Ajoutez un millilitre de PBS et laissez les manchons se déposer par gravité. Aspirez ensuite le PBS à l’aide d’une micropipette. Jetez le liquide et répétez cette étape une fois de plus.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres d'acide trichloroacétique glacé dans les orifices et incubez-les sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifugez les tubes à quatre degrés Celsius. Puis aspirez et jetez l'acide TCA.

Ensuite, ajoutez 80 microlitres de soude 0,3 normale et incubez les embouts pendant 30 minutes à température ambiante. Pendant cette incubation, vortexez vigoureusement les échantillons pendant cinq à dix secondes toutes les dix minutes. En parallèle, ajoutez quatre millilitres d'un cocktail de comptage conno safe dans des tubes de comptage par scintillation liquide de sept millilitres.

Lorsque l'incubation des cupules est terminée, ajoutez 50 microlitres des cupules dans un tube à scintillation. Agitez brièvement le tube bouché et mesurez la radioactivité des échantillons à l'aide d'un compteur à scintillation liquide. Pour mesurer également la concentration en protéines, transférez 10 microlitres de vilas dans un dosage commercial à l'acide bionique et suivez le protocole du fabricant.

Plus tard, lors de l'analyse des données, normalisez les résultats à la concentration en protéines en utilisant les protocoles décrits. Reproduction des îlots et fonction des cellules bêta. Chez le rat, une surexpression adénovirale du gène hypothétique six a fortement stimulé la reproduction des îlots sans modifier la fonction des cellules bêta.

Une expression accrue du gène six, une synthèse accrue d'ADN mesurée par l'incorporation de thymidine, car la majorité des cellules de l'œillet de rat sont des cellules bêta. Des expériences supplémentaires pourraient montrer que cet accroissement de l'incorporation de thymidine est dû à une augmentation de la réplication des cellules bêta. Le test de sécrétion d'insuline a démontré que la surexpression du gène six n'a pas modifié l'une des fonctions principales des cellules bêta, à savoir la sécrétion d'insuline, en présence de glucose faible ou élevé.

L'augmentation de la sécrétion d'insuline à de faibles et fortes concentrations de glucose reflète la santé des îlots après traitement avec l'adénovirus. Si l'augmentation de l'expression du gène six compromettait la fonction des cellules bêta, cela se manifesterait probablement par une diminution de l'insuline sécrétée à de fortes concentrations de glucose stimulées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer la réplication des cellules bêta et la sécrétion d'insuline afin de déterminer si un gène particulier influence la croissance ou la fonction des cellules bêta.