C. elegans Suivi et évaluation comportementale

Phénotypage. La locomotion de la nématode est un outil important pour l'identification des gènes et des neurones impliqués dans le comportement de la nématode. Celle-ci exécute des comportements locomoteurs stéréotypés, tels que des mouvements en avant et en arrière, ainsi que différents types de virages, en modifiant sa forme. Afin de quantifier ces déplacements sur de longues distances et avec une haute résolution spatiale et temporelle, nous avons conçu un système de suivi de nématodes permettant d'enregistrer le mouvement de la nématode lorsqu'elle se déplace à la surface d'une boîte de Pétri contenant un milieu gélosé.

Nous avons également mis au point un logiciel permettant d'isoler et d'analyser quantitativement ces mouvements à l'aide de programmes personnalisés écrits dans LabVIEW et MATLAB. Un défi inhérent à tous les systèmes de suivi vidéo est qu'ils génèrent une quantité énorme de données fortement dimensionnelles. Notre programme de traitement d'images et d'analyse de données fait face à ce défi en réduisant les formes des vers à un ensemble de composantes indépendantes, permettant ainsi de reconstruire de manière exhaustive le comportement du ver en fonction de seulement trois à quatre dimensions.

Une plaque d'agar est illuminée par une source lumineuse à fibre et capturée à l'aide d'une caméra. Ce système est monté sur une platine de translation XY. La platine est déplacée par des moteurs pas à pas standards, qui sont connectés à un contrôleur de moteur pas à pas.

Le contrôleur et la caméra sont connectés à l'ordinateur et sont commandés par des programmes personnalisés écrits en LabVIEW. La caméra acquiert l'image de la surface d'une boîte de Petri et identifie les objets sombres sur un fond clair. Une marque d'étalonnage pour le processus d'étalonnage automatique est réalisée en piquant la surface de l'agar.

Avec un pic à vers, la qualité de l'image est ajustée afin que le programme informatique puisse quantifier les objets en temps réel. Le gain, la luminosité et la vitesse d'obturation de la caméra peuvent être réglés pour obtenir un objet sombre sur un fond blanc. On peut vérifier l'image binaire filtrée, qui est utilisée par le programme de suivi.

Le logiciel dispose d'une fonction d'étalonnage automatique qui calcule la matrice d'étalonnage en déplaçant un objet test sur une distance fixe. Les distances exprimées en pixels sont étalonnées en fonction des pas effectués par le moteur pas à pas grâce à la matrice d'étalonnage.

Après l'étalonnage, le système est prêt à l'emploi et n'a pas besoin d'être réétalonné, sauf si le grossissement est modifié ou si la caméra est repositionnée. Un anneau de cuivre sera utilisé pour regrouper les vers et les empêcher de migrer vers le bord de la boîte. Chauffez d'abord l'anneau en le plaçant sur un bloc chauffant ou un dispositif équivalent.

L'anneau doit être chauffé pendant environ une minute. Placez l'anneau sur une nouvelle boîte de gélose et appuyez légèrement pour l'incorporer à la surface de la gélose. Une boîte de gélose contenant du tampon NGM sera utilisée pour laver les vers de stade L4 et adultes jeunes afin d'éliminer les résidus d'aliment.

Après avoir transféré les vers dans le tampon NGM, laissez-les nager quelques minutes. Placez délicatement un des vers lavés sur la plaque de suivi, près du centre de l'anneau. Cette plaque sera ultérieurement utilisée pour le suivi des vers.

Placer la plaque préparée sur la platine du traqueur de vers. Exécuter le programme LabVIEW et sélectionner les options souhaitées, telles que l'emplacement des images, les types d'images, les mesures et les paramètres de la caméra. À l'aide du joystick, déplacer le microscope jusqu'à ce qu'une image du ver apparaisse dans le champ de vision à l'écran de l'ordinateur.

Ensuite, appuyez sur la touche de suivi pour activer le programme de trajectoire. Ici, nous montrons un vers dont la trajectoire est suivie en temps réel. Le programme informatique mesure les mouvements d'images binaires filtrées comme indiqué et peut effectuer des mesures sur cette image en temps réel.

Après le suivi, une reconstruction de la trajectoire globale peut être réalisée à partir des déplacements du moteur pas à pas, tandis que les changements locaux de forme du ver peuvent être observés en détail. Les vers se déplacent en effectuant des mouvements ondulatoires. Nous capturons ces mouvements en squelettisant le ver sous forme d'une courbe centrale unique, puis en décrivant cette courbe par un ensemble d'angles.

Nous décomposons ensuite les squelettes en leurs formes fondamentales, également appelées vecteurs propres. Grâce à ces modes propres, nous pouvons reconstruire les formes du ver et quantifier ses mouvements. En utilisant les deux premiers modes, nous pouvons spécifiquement capturer la position de phase du cycle ondulatoire du ver, comme illustré dans le deuxième panneau.

Le premier panneau montre la distribution conjointe des modes un et deux, mettant en évidence un cycle limite circulaire. Le déplacement de phase dans un sens correspond à un mouvement vers l'avant, et le déplacement de phase dans l'autre sens correspond à un mouvement vers l'arrière. Ainsi, la vitesse de phase correspond à la vitesse du ver.

Dans l'espace réel, la forte corrélation entre la phase et la vitesse dans le monde réel est visible dans le dernier panneau. En utilisant la vitesse de phase dérivée du mode propre, nous pouvons révéler certains détails subtils du comportement de la nage des vers, qui passeraient inaperçus à l’œil nu. Par exemple, la distribution conjointe de la vitesse de phase et de la phase indique clairement que les vers quittent et reprennent l'état de progression préférentiellement à des phases spécifiques du mouvement.

Ici, nous avons démontré un système de suivi facile à utiliser qui enregistre des images détaillées du comportement des siliciums lorsqu'ils rampent à la surface et sur les plaques ACA. La quantité d'informations contenue dans ces images est considérable et fortement dimensionnelle ; c'est pourquoi nous avons également mis au point une méthode permettant de réduire la dimensionnalité des données à quatre mesures fondamentales. Ces mesures sont faciles à interpréter en lien avec le comportement du ver.

Ce travail a été conçu pour mesurer le comportement des vers présentant de faibles modifications, et le système peut également être utilisé pour mesurer l'activité neuronale à l'aide de régions marquées génétiquement et recouvertes. L'ensemble du système, de conception souple, peut être utilisé avec d'autres systèmes de déplacement tels que Doof law, LOEs.