Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Cette technique standard permet d'obtenir des lamelles recouvertes de gélatine marquée au fluorochrome, adaptées aux dosages quantitatifs de la dégradation de la matrice par les invadopodes. Après avoir recouvert les lamelles avec de la gélatine marquée au fluorochrome, ensemencez les cellules et cultivez-les pour induire la dégradation de la matrice. Ensuite, fixez les cellules et coloriez-les au fluorochrome pour les protéines marqueurs des invadopodes, acquérez les images et quantifiez la dégradation de la matrice.

Les résultats typiques permettent de quantifier les différences de dégradation de la matrice médiée par les invadopodes entre des cellules ayant subi une modulation différentielle de gènes sélectionnés ou un traitement par des agents pharmacologiques. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la préparation de lamelles recouvertes de gélatine présentant une fluorescence homogène est difficile à obtenir en raison d’un dépôt inégal de la gélatine fluorescente ou d’une manipulation inadéquate des lamelles recouvertes de gélatine. La procédure sera démontrée par la professeure adjointe de recherche Karen Martin, l’associée postdoctorale Mandy Ammer et les étudiants diplômés Elise Walk, Karen Hayes et Steve Markwell.

Pour préparer la solution mère de gélatine-saccharose à 5 % non marquée, mélanger la gélatine et le saccharose dans du PBS et les dissoudre complètement à 37 degrés Celsius. Conserver ensuite à quatre degrés Celsius. Passer ensuite au nettoyage des lamelles en verre.

Répartir un coverslip individuel dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire en plastique de 24 puits, ajouter 500 microlitres d'acide nitrique à 20 % dans chaque puits et incuber pendant 30 minutes. Après élimination de la solution d'acide nitrique, laver les coverslips trois fois avec de l'eau déionisée. Ensuite, appliquer le revêtement.

Chaque lame est recouverte de 500 microlitres d'une solution de polyol, de lycine à 50 microgrammes par millilitre, puis incubée pendant 20 minutes à température ambiante. Retirer la solution de polylysine et rincer trois fois avec du PBS. Le revêtement de polylysine favorise un dépôt uniforme et l'adhérence du gélatine marquée superposée. Placer les plaques à 24 puits sur de la glace et ajouter 500 microlitres de glutaraldehyde 0,5 % fraîchement préparé dans chacun.

Incuber soigneusement les plaques sur de la glace pendant 15 minutes. Effectuer trois lavages avec du PBS froid, puis aspirer toutes les traces de PBS avant le revêtement à la gélatine. Entre-temps, durant l'incubation au glutaraldéhyde, reconstituer la gélatine marquée à l'Oregon Green 488.

Suivant le protocole du fabricant, réchauffez-le ainsi que la solution mère de gélatine-saccharose 5 % non marquée à 37 degrés Celsius. Ensuite, diluez 500 microlitres de gélatine marquée dans quatre millilitres de gélatine non marquée. Appliquez 100 microlitres du mélange de gélatine 488 diluée sur chaque lamelle à l’aide d’une pipette à saccharose.

Utiliser suffisamment de gélatine pour recouvrir la lame sans étalage manuel. Il est important de maintenir le mélange de gélatine diluée 488 à 37 degrés pendant la procédure d'encollage afin d'éviter une solidification prématurée. À partir de cette étape, garder les lames à l'abri de la lumière autant que possible pour éviter un éventuel blanchiment photo-induit.

Une fois tous les lamelles recouverts dans une seule plaque, inclinez la plaque et retirez le surplus de gélatine de chaque puits par aspiration sous vide. Incubez ensuite les lamelles recouverts à l’obscurité pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les lamelles trois fois avec du PBS, ajoutez 500 microlitres de borohydrure de sodium, hydride, borohydrure de sodium.

L'hydrure est effervescent et de petites bulles seront visibles sur et autour de chaque lamelle. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante pour réduire et inactiver le glutaraldéhyde résiduel. Retirer la solution d'hydrure de sodium par aspiration sous vide en effectuant un mouvement rapide et balayant autour de l'extérieur de chaque puits, en prenant soin de ne pas aspirer les lamelles flottantes qui se seraient détachées du fond de la plaque de culture cellulaire pendant le traitement à l'hydrure de sodium. Après trois lavages au PBS, incuber les lamelles dans de l'éthanol à 70 % pendant 30 minutes à température ambiante.

En utilisant une technique stérile, transférez la lame porteuse contenant les plaques dans une hotte à flux laminaire de type II pour culture de cellules B et rincez la lame trois fois avec du PBS stérile à l’aide d’une aiguille stérile et de pinces. Transférez soigneusement les lames vers un puits vide d’une nouvelle plaque de 24 puits à équilibrer. Incubez les lames avec le milieu de culture adapté au type cellulaire spécifique en cours d’acidification.

Ensuite, ensemencez directement les cellules sur les lamelles après un temps d'incubation approprié. Traitez les échantillons pour l'imagerie en immunofluorescence afin de les monter. Déposez une goutte de Prolong Gold Anti-Fade ou d'un réactif similaire sur une lame de microscope, puis positionnez délicatement la lamelle retournée. Acquérez ensuite les images pour analyse.

Cette analyse fournit la surface de dégradation de la matrice normalisée par rapport à la surface des cellules ou au nombre de cellules. Elle est utile pour analyser des champs microscopiques complets contenant plusieurs cellules ayant été traitées collectivement avec des facteurs de croissance irna ou des agents thérapeutiques. Pour cette analyse, des images sont acquises à un grossissement inférieur suffisant pour recueillir efficacement des informations sur des populations cellulaires.

Ouvrez l'image dans ImageJ. Vérifiez les informations d'échelle et sélectionnez les mesures. Choisissez la zone et limitez aux options de seuil. Calculez la surface de dégradation en utilisant l'image de gélatine fluorescente, en corrigeant l'illumination inégale de la gélatine en soustrayant le seuil du fond, puis ajustez l'image pour définir les valeurs d'intensité des pixels supérieure et inférieure.

Dans les images suivantes, utilisez le bouton de réglage de la fenêtre de seuil pour appliquer le même seuil à toutes les images, afin d'adopter un critère objectif pour sélectionner la zone de dégradation. Utilisez la fonction « analyser les particules » pour mesurer le seuil dans les zones de dégradation matricielle.

Choisissez une taille de particule supérieure à zéro pour éliminer le bruit dans la sélection. Affichez les contours afin d'identifier les régions d'intérêt. Ensuite, activez afficher les résultats et résumer pour visualiser les mesures si le dessin a délimité précisément toutes les zones de dégradation.

Copiez la mesure de la surface totale dans une feuille de calcul ; si d'autres objets ont été sélectionnés, comme des débris, enregistrez uniquement les surfaces des régions d'intérêt pertinentes. Ensuite, pour calculer la surface cellulaire, ouvrez le dossier et l'image colorée, puis ajustez le seuil de l'image afin de définir les valeurs d'intensité des pixels supérieure et inférieure de manière à ce que les contours des cellules soient sélectionnés sur les images suivantes. Utilisez le bouton « Définir » dans la fenêtre de seuil pour appliquer le même seuil à toutes les images.

Comme moyen objectif pour sélectionner la surface cellulaire. Utilisez la fonction de mesure des particules pour déterminer le seuil de surface des cellules. Choisissez une taille de particule supérieure à zéro afin d'éliminer le bruit de la sélection.

Afficher les contours pour identifier les régions destinées à l'analyse, vérifier les résultats affichés et résumer afin de montrer les mesures de surface. Ne pas cocher. Inclure les trous s'il existe des espaces entre les cellules et un agrégat.

Choisissez maintenant. Copiez les résultats des zones pour les régions d'intérêt pertinentes dans un tableur et calculez la surface de dégradation de la gélatine par rapport à la surface totale des cellules. Une approche alternative consiste à normaliser la surface de dégradation au nombre de cellules, déterminé par le comptage des noyaux colorés au DAP e.

Ceci est important si les manipulations modifient la surface moyenne des cellules. Pour cette approche, utilisez le greffon de comptage des noyaux afin de compter automatiquement les noyaux. Ajustez les options pour optimiser selon vos images. Si les noyaux se chevauchent largement, le comptage automatique peut ne pas fournir une énumération précise dans ce cas.

Le comptage manuel peut être facilité à l'aide du module complémentaire de comptage cellulaire lorsqu'il est correctement effectué. Les lamelles sont uniformément recouvertes de gélatine conjuguée à l'Oregon Green 488. Plusieurs artefacts peuvent survenir lors du revêtement et du traitement des lamelles recouvertes de gélatine.

Par exemple, un revêtement inégal résulte d'une couverture inadéquate de la lame couvre-objet pendant le processus de revêtement, en raison d'un mélange insuffisant, d'une répartition manuelle ou d'une solidification partielle du mélange de gélatine. Les rayures indiquent le retrait de la matrice revêtue par griffage à l'aide d'aiguilles ou de pinces lors de la manipulation. Le dessèchement de la surface de la lame couvre-objet pendant de longues périodes de stockage peut entraîner un aspect en pavé. Cette zone reflète la décoloration photo-induite de la surface fluorescente de gélatine pendant l'acquisition d'images, due à une exposition prolongée ou intense à la lumière.

Remarquez comment un lamelle bien préparée présente une fluorescence homogène lorsqu'elle est visualisée par microscopie. Les matrices minces obtenues au cours de cette procédure offrent un moyen sensible d'évaluer la capacité des cellules à dégrader la MEC. Par exemple.

Ces images illustrent l'activité de dégradation de la matrice du podium envahie par une cellule cancéreuse OSC 19 de la tête et du cou. Ici, les cellules ont été ensemencées sur un glissement de couverture en gélatine conjuguée à l'Oregon Green 488 et observées par microscopie fluorescente, comme le montrent les images en 2D et en 3D. Ces cellules OSC 19 ensemencées sur des glissements de couverture en gélatine conjuguée à l'Oregon Green 488 ont été marquées à l'aide de phalloïdine conjuguée à R domine et d'anticorps anti-actine corticale, visualisés à l'aide d'un anticorps secondaire ANOR 647, puis colorées artificiellement en vert pour représenter l'invasion.

Les podia sont visibles dans l'image fusionnée comme des concentrations cytoplasmiques focalisées d'actine F et de cortane qui se superposent aux zones de volume de dégagement de gélatine. La visualisation montre comment les podia envahissants pénètrent dans le sous-volume ECMA, créé pour révéler un bord à l'intérieur de la cellule où sont présents les podia invasifs. La vue du bord dorsal démontre les podia invasifs insérés dans la gélatine sous-jacente.

La vue en coupe du bord ventral montre des protrusions dans les podia de Veda et des zones de dégradation de la gélatine sous la lamelle couvre-objet, visibles en rouge sur une matrice verte. Ces images illustrent certaines étapes importantes pour la quantification de la dégradation normalisée de la matrice de gélatine par les cellules dans une image microscopique complète. Toutes les images de fluorescence ont été converties en niveaux de gris afin de mieux visualiser le seuillage rouge et les délimitations des régions d'intérêt.

Cette image de gélatine conjuguée à Oregon Green 488 montre les zones sombres où une dégradation s'est produite. Le seuillage de l'image de gélatine met en évidence les zones de dégradation, à partir desquelles des régions d'intérêt sélectionnées sont mesurées pour déterminer la surface de dégradation. Cette image montre une rumine, un foid et une coloration de l'actine F, conformément aux attentes.

Le seuil appliqué à l'image de l'actine met en évidence la surface totale de la cellule à partir de laquelle sont sélectionnées les surfaces cellulaires à mesurer. De la même manière, cette technique peut être appliquée à l'étude d'images de noyaux cellulaires colorés au DAPI. Ce panneau illustre certaines étapes nécessaires à la quantification de la dégradation fluorescente de la gélatine par des cellules individuelles au sein d'une population cellulaire mixte.

Cette quantification simple concerne une seule cellule OSC 19 transfectée surexprimant la cortactine recombinante fusionnée à une étiquette d'épitope flag. Remarquez comment la dégradation de la matrice par les cellules transfectées peut également être analysée au sein d'une population mixte de cellules transfectées et non transfectées. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit plusieurs éléments.

Tout d'abord, assurez-vous que vos marqueurs fluorescents cellulaires ne se chevauchent pas avec la couleur de la gélatine fluorescente. Lors de la collecte d'images, il est important de choisir les champs en fonction de la présence de cellules. N'allez pas rechercher de façon privilégiée les zones de dégradation, car cela pourrait biaiser les données en raison de la variabilité entre les lignées cellulaires et leurs réponses à divers agents thérapeutiques.

Des facteurs tels que le temps de dégradation du nombre de sièges et le choix des protéines pour le marquage immunofluorescent doivent être optimisés selon votre expérience particulière. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode permettant de produire des lamelles uniformément recouvertes de gélatine fluorescente pour les dosages de dégradation médiée par les podia bêta, ainsi que des méthodes de quantification de la dégradation de la matrice.