L'étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières

L'objectif de cette procédure est de suivre la manière dont la protéolyse de la cycline B régule le début de l'anaphase et la sortie de la mitose. Cela est réalisé en semant d'abord des cellules rapporteuses de la cycline B sur des lames de microscopie. La deuxième étape consiste à marquer la molécule rapporteuse chimérique de la cycline B avec le substrat fluorescent TMR star.

Ensuite, les séries d'images sont acquises sur une station de microscopie. La dernière étape consiste à analyser les cellules et à calculer l'intensité de fluorescence du TMR star en fonction du temps, ce qui reflète la protéolyse de la cycline B. En définitive, la microscopie en immunofluorescence de cellules rapporteuses vivantes révèle la cinétique de la protéolyse de la cycline B qui se déroule pendant la mitose.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la surveillance du cyclone BGFP, est que le cyclone B SNAP permet de suivre la dégradation du cyclone B plutôt que l'expression totale des protéines. Les cellules rapporteuses SNAP pour cette expérience sont d'abord laissées à croître de manière asynchrone en phase logarithmique pendant au moins 48 heures. Pour commencer, la procédure de semis de la trypsine consiste à utiliser des cellules rapporteuses SNAP en sous-confluence afin de semer les cellules dans des chambres microscopiques à huit puits avec une distribution constante sur toute la surface de la centrifugeuse de chambre.

10 000 cellules et le milieu de ressuscitation dans 350 microlitres d’un milieu de croissance normal sans rouge de phénol. Transférez la suspension cellulaire dans la chambre du microscope pour l’ensemencement des cellules dans des chambres microscopiques à huit puits, avec une densité cellulaire maximale au centre de la chambre. Remplissez d’abord la chambre avec 300 microlitres de milieu de croissance normal sans rouge de phénol.

Ensuite, ajoutez soigneusement 5 000 cellules au centre de la chambre du microscope pour semer les cellules dans des plaques 96 puits à optique spéciale avec une distribution constante sur toute la surface du puits. Centrifugez à 5 000 cellules et resuspendez dans 300 microlitres de milieu de croissance normal sans rouge de phénol, selon le nombre total de puits contenant des cellules requis. Ajustez le nombre de cellules et le volume total du milieu de suspension.

Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans une plaque de 96 puits pour la mise en culture des cellules dans des plaques optiques spéciales de 96 puits présentant une densité cellulaire maximale au centre de chaque puits. Ajoutez soigneusement 1 500 cellules dans 15 microlitres de milieu de croissance normal sans rouge de phénol sous forme d'une petite goutte au centre de chaque puits.

Cela limitera la croissance cellulaire au centre du puits. Laisser toutes les cellules semées croître pendant au moins 18 heures dans des conditions standard de culture cellulaire, 30 minutes avant le début de la procédure de coloration. Préchauffer les milieux de croissance normaux sans phénol rouge à 37 degrés Celsius.

Le substrat de fixation dans cette démonstration est l'étoile TMR, afin de faciliter la manipulation. Dissoudre l'étoile TMR dans du DMSO pour obtenir une solution mère à une concentration de 400 micromolaire. Diluer 0,5 microlitre de la solution mère d'étoile TMR dans 200 microlitres de milieu de croissance normal sans phénol rouge, préalablement réchauffé, afin d'obtenir une concentration finale d'étiquetage de un micromolaire. Ensuite, retirer le milieu de croissance normal des cellules en croissance asynchrone et le remplacer par le milieu d'étiquetage. Incuber les cellules dans le milieu d'étiquetage pendant 25 minutes dans des conditions de culture standard.

Après 25 minutes, retirez le milieu de marquage et lavez les cellules quatre fois avec du milieu de croissance normal sans phénol rouge, préchauffé. Après le dernier lavage, incubez les cellules dans 300 microlitres de milieu de croissance normal sans phénol rouge, préchauffé, pendant 30 minutes avant de les transporter au microscope. Remplacez le milieu par du milieu de croissance normal sans phénol rouge, frais et préchauffé, afin d'éliminer le substrat marqueur excédentaire, puis transportez les cellules au microscope dans une boîte en polystyrène sur un bloc chauffant préchauffé à 37 degrés Celsius.

Pour minimiser les variations de température, régler la température de l'air dans la chambre climatique à 37 degrés Celsius en mode sec deux heures avant la mesure de l'intensité de fluorescence, afin de porter le microscope et tous ses composants à la température souhaitée. Pour éviter la condensation et les dommages subséquents au microscope, il est important de préchauffer avant de régler l'humidité.

Lorsque l'ensemble du système de microscope a atteint 37 degrés Celsius, réglez l'humidité de l'air à 60 % et la concentration en dioxyde de carbone à 5 %. Lancez le logiciel de balayage ou d'acquisition et définissez les paramètres standards. Définissez les positions des puits à analyser. Définissez le delta T ou le temps de cycle d'acquisition ainsi que le nombre absolu de cycles d'acquisition.

Dans cette démonstration, l'autofocus matériel est pré-sélectionné pour l'analyse d'un plus grand nombre de puits. Lancez l'acquisition et surveillez les deux premiers cycles d'acquisition.

Le microscope se concentrera sur le signal de l'histone H2A GFP, puis acquerra une première image dans ce canal, avant que le filtre ne soit changé et que l'image correspondante de TMR star ne soit acquise. Ceci est ensuite répété pour toutes les positions d'un puits et pour chacun des puits à examiner, avant de recommencer le cycle suivant. Pour analyser les profils protéolytiques, lancez le logiciel d'analyse Scan R.

Analyser les images avec les noyaux cellulaires visualisés par l'histone H2A-GFP, définis comme l'objet principal à l'aide d'un seuil basé sur l'intensité du signal et d'un algorithme de ligne de partage des eaux pour aider à séparer les cellules voisines. Un sous-objet composé du noyau et du cytoplasme doit être créé pour l'analyse du TMR star. Les propriétés importantes de l'objet principal sont les positions X et Y, le temps, les intensités maximales et moyennes de la GFP pour l'objet principal, ainsi que l'intensité totale divisée par la surface.

Pour le sous-objet étoile TMR, passez en mode traçage afin de visualiser l'intensité moyenne de fluorescence de l'étoile TMR au fil du temps ou les tracés cellulaires attribués aux objets principaux analysés. L’observation d’un plus grand nombre de cellules permet une première vue représentative et objective, mais le nombre de cellules à examiner peut être réduit en appliquant un tri sur les mesures d’une durée d’au moins 140 cycles et présentant une intensité maximale élevée de l’histone H deux GFP. Sélectionnez un tracé cellulaire d’intérêt pour visualiser simultanément, au niveau individuel de la cellule, la fluorescence de l’histone H deux GFP et celle de l’étoile TMR.

À l’aide du bouton droit de la souris, cliquez sur une cellule d’intérêt et générez une image exportable. Galerie illustrant l’histone H deux GFP et le cycline B snap TMR star pour chaque point temporel. Passez en mode population dans le logiciel d’analyse du scanner et délimitez la région où la cellule d’intérêt est représentée sur le dot blot.

Appliquez une nouvelle fenêtre de diagramme de dispersion à la région sélectionnée et visualisez l'intensité moyenne de fluorescence de TMR star en fonction du temps. Exportez les données vers Microsoft Excel pour des calculs supplémentaires. Les figures ci-dessous illustrent la cinétique de la cycline B, représentée par une courbe d'intensité de fluorescence de TMR star pour une cellule traversant une mitose régulière, sans signe de mauvais alignement chromosomique lors de la condensation du cytoplasme après la rupture de l'enveloppe nucléaire, ou NEBD, comme indiqué par le triangle rouge. L'intensité de fluorescence de TMR staph montre une augmentation brutale jusqu'à l'atteinte de la fenêtre isomorphe.

Lorsque la cellule entre en prométaphase, l'intensité de fluorescence reste à un niveau stable tant que la cellule progresse à travers la prophase et la métaphase, puis commence à chuter rapidement. Dès que tous les chromosomes ont formé une plaque métaphasique stable, cette diminution précède la séparation des chromosomes. Pendant l'anaphase, indiquée par le point bleu sur la courbe en fin de mitose, la chromatine commence à se décondenser et la cellule adopte une morphologie en phase.

Alors que la courbe de l'intensité de fluorescence atteint un plateau, inférieur au plateau observé avant la mitose après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la mitose pour explorer l'équilibre précis entre le cycle cellulaire, la dégradation et la synthèse qui régulent la progression mitotique.