Souris îlot de Langerhans isolement à l'aide d'une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

L'objectif général de cette procédure est d'isoler avec succès les îlots pancréatiques à partir du pancréas d'une souris. Cela est réalisé en premier lieu en isolant le pancréas des tissus environnants. Ensuite, le canal biliaire est canulé afin de permettre l'insufflation du pancréas avec le mélange de protéase au collagénase.

Une fois gonflé, le pancréas est retiré et les îlots sont soigneusement dissociés. Enfin, les îlots isolés sont filtrés et mis en culture pour une utilisation ultérieure. En définitive, cette méthode d'isolement des îlots à l'aide de collagénase purifiée et de protéase neutre est utilisée pour obtenir un rendement maximal d'îlots et une morphologie optimale des îlots.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d'isolement des œillets est que nous avons éliminé la variabilité entre lots en utilisant des enzymes purifiées. De plus, nous avons modifié ou amélioré certains protocoles afin d'améliorer la morphologie des œillets. Après l'euthanasie, recouvrez le tronc avec de l'éthanol à 70 % avant d'ouvrir complètement la cavité abdominale de l'anus jusqu'au diaphragme.

Placez ensuite la souris sur la plateforme d'un microscope stéréoscopique. Extrayez le caecum et le côlon ascendant et positionnez-les à l'extérieur de la cavité corporelle du côté gauche ; déplacez les lobes du foie contre le diaphragme. S'ils ne restent pas en place d'eux-mêmes, élargissez l'ouverture de la cavité corporelle.

Saisir le duodénum avec des pinces courbes et localiser le cordon artère hépatique, veine porte et canal biliaire menant au foie. Avec une autre paire de pinces courbes, insérer une suture sous le cordon artère-veine-canal et serrer aussi près que possible du foie.

À l’aide de deux paires de pinces courbes, saisir délicatement le duodénum et localiser le canal cholédoque fixé à la papille. À l’aide d’une branche de la pince, percer le pancréas et les tissus conjonctifs situés juste sous le canal cholédoque et près de la papille. Rapidement, introduire la pince à travers l’orifice et insérer un fil de suture. Nœud lâche. Faire passer le fil autour du canal cholédoque afin de former un petit cercle, en utilisant des pinces à 90 degrés.

Tirer délicatement l'intestin grêle jusqu'à ce que le canal biliaire soit tendu. Effectuer une incision horizontale au niveau de la papille à l'aide de ciseaux très fins, sans déloger le canal biliaire de la papille, tout en maintenant l'intestin. Insérer une canule dans le canal biliaire, puis serrer doucement le fil autour de la canule.

Ensuite, remplissez une seringue de trois millilitres avec 2,0 millilitre de mélange de collagénase et de protéase. Injectez ce mélange dans la canule à un rythme lent et constant. Une fois l'insufflation du pancréas terminée, retirez la canule du canal biliaire.

En partant du côlon descendant, sectionner le tissu conjonctif tout en tirant sur les intestins vers le haut jusqu'à atteindre le canal cholédoque. Ensuite, séparer le pancréas de la rate et des tissus environnants. Enfin, couper les points de suture et retirer le pancréas.

Une fois prélevé, placer le pancréas dans un tube de 50 millilitres contenant cinq millilitres de HBSS sur de la glace. Une fois tous les échantillons recueillis, placer les tubes de 50 millilitres contenant le tissu pancréatique dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Agiter doucement le tube pendant 15 minutes et vérifier la dissociation du tissu.

Vérifiez que le tissu se dissocie facilement en tenant le tube par le couvercle. Agitez doucement 12 fois pour dissocier davantage le tissu. Ajoutez au plus 30 millilitres de HBSS et centrifugez.

Aspirez soigneusement le surnageant et laissez une petite quantité de surnageant au fond afin de ne pas perturber le culot cellulaire. À l’aide d’une seringue de 30 millilitres munie d’une aiguille de calibre 14, ajoutez au maximum 10 millilitres de HBSS et aspirez la suspension de haut en bas deux fois. Filtrez le mélange cellulaire à travers un tamis plastique en forme de T dans un tube de 50 millilitres.

Rincez avec encore 10 millilitres de HBSS et centrifugez. Jetez le surnageant et retournez les tubes pour les faire égoutter sur du papier absorbant pendant une minute. Résuspendez chaque tube dans 10 millilitres.

Froid 1100. Son recouvrement opaque, son recouvrement opaque avec 10 millilitres, HBSS et centrifuger. Éliminer complètement les 20 millilitres de surnageant à l’aide d’une pipette large orifice de 25 millilitres et faire passer le surnageant à travers un filtre inversé de 70 microns.

Filtrez les œillets directement dans une boîte de Pétri et rincez-les en pipetant 10 millilitres de milieu pour œillets à travers la culture sur filtre. Conservez les œillets dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à leur utilisation expérimentale. Les rendements en œillets, leur morphologie et leur qualité sont les paramètres généraux utilisés pour évaluer le succès de l’isolement des œillets.

La morphologie typique des œillets est présentée ici. Les œillets ont une forme ronde à oblongue avec une taille relativement uniforme. Des œillets isolés ont été analysés pour la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose.

La stimulation à l'insuline était similaire entre les îlots préparés à l'aide de Sigma Type 11 et ceux préparés avec ci zyme TM, MABP, indiquant une qualité élevée de la préparation des îlots. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment canuler le canal cholédoque d'une souris. Travaillez avec la zyme collagénase et les neutroprotéases pour isoler vos îlots afin de les utiliser dans n'importe quel dosage.