Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné

L'objectif général de cette procédure est d'améliorer la détection des micro-métastases dans le poumon de souris ex vivo tout en préservant l'architecture des poumons gonflés. Ceci est réalisé en perfusant d'abord le poumon in situ avec du PBS afin d'éliminer le sang, qui constitue la principale source de fond coloré dans ce tissu. Les étapes suivantes consistent à insuffler le poumon par injection de PFA, puis à le pincer pour fixer le tissu pulmonaire sous inflation.

Ensuite, le poumon est prélevé et fixé davantage dans du PFA, ou des lobes pulmonaires individuels sont inclus pour la cryoséction. Les étapes finales consistent à colorer les tissus dans une solution Xal et à visualiser les cellules tumorales LA zag ; enfin, les métastases peuvent être détectées au niveau des lobes pulmonaires entiers ou dans des sections de tissu pulmonaire jusqu'au niveau de la cellule unique à l'aide d'un microscope binoculaire ou d'un microscope optique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le sky standing on its own, est que la détection des micro-métastases est considérablement améliorée grâce à l'élimination du bruit de fond lié au sang.

Commencez le protocole en anesthésiant une souris par une injection intrapéritonéale de kétamine, de xylazine et d'acépromazine dans environ 150 microlitres de PBS. Lorsque les réflexes douloureux de la souris ne sont plus observés, fixez-la sur la table d'opération. Rabaissez-vous puis lissez le pelage avec de l'éthanol à 70 %.

Ouvrir la peau depuis l'abdomen jusqu'au cou. Écarter la peau sur les côtés ou l'ôter. Ouvrir soigneusement le péritoine dans le thorax afin d'éviter la rupture de gros vaisseaux tels que les veines jugulaires.

Cela améliorera l'efficacité de la perfusion. Coupez maintenant la veine cave cardiaque sous le foie à l’aide d’une seringue de 20 millilitres munie d’une aiguille de 21 à 24 gauge. Injectez lentement 10 à 15 millilitres de PBS dans le ventricule droit du cœur en activité jusqu’à ce que le poumon devienne complètement blanc et que le cœur cesse de battre.

Ensuite, pincer les vaisseaux sanguins au-dessus du foie et du diaphragme à l’aide d’un clamp vasculaire. Remplir une seringue de 10 millilitres avec du paraformaldéhyde à 3 %, puis injecter environ deux millilitres dans le ventricule droit à l’aide d’une aiguille de calibre 21 à 24.

Découvrez la trachée en dehors du thorax et insufflez les poumons par une injection dans la trachée de environ trois millilitres d'aldéhyde depuis l'extérieur du thorax. Ensuite, immédiatement après avoir retiré l'aiguille, pincez la trachée au niveau du point de ponction à l'aide d'un clamp vasculaire et attendez 10 minutes pour permettre la fixation. Ensuite, sectionnez les vaisseaux sanguins situés au-dessus du clamp vasculaire.

Ensuite, retirez le clamp et injectez environ deux millilitres de PBS dans le ventricule droit afin d'éliminer l'excès de formaldéhyde. Percez avec une aiguille les parties inférieures de tous les lobes pulmonaires et retirez le clamp vasculaire au niveau de la trachée. Injectez maintenant trois à cinq millilitres de solution d'inclusion diluée dans la trachée, en coordonnant cette injection avec la précédente.

Arrêtez l'injection lorsque la paraforme cachée dans les lobes pulmonaires est remplacée par la solution. Retirez soigneusement le poumon en tirant sur le cœur à l’aide d’une pince et en sectionnant les ligaments conjonctifs, les vaisseaux sanguins et la trachée. Veillez à maintenir le cœur relié aux poumons.

Mettre de côté un lobe pour les coupes cryogéniques et utiliser le tissu pulmonaire restant pour la coloration du poumon entier. Placer le poumon dans un récipient en plastique avec un couvercle hermétique et le fixer avec du formaldéhyde à 2 % dans du PBS. Déposer un morceau de gaze sur le poumon afin de le maintenir dans la solution et laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes.

Après une demi-heure, retirez la solution de fixation et lavez soigneusement le tissu avec du PBS trois fois. Préparez fraîchement la solution de Xal prête à l'emploi en diluant un millilitre de solution mère de Xal, une fois sur quarante, dans la solution de coloration de base, puis ajoutez-y au moins 10 millilitres de cette solution. Immergez le poumon avec un morceau de gaze. Fermez le couvercle légèrement afin de permettre les échanges gazeux et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq heures, à l'abri de la lumière.

Après l'incubation, retirez la solution de xal. Rincez les poumons une fois avec du PBS pour éliminer la solution de xal résiduelle et ajoutez au moins 10 millilitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS. Le tissu est désormais prêt pour l'histologie et peut être conservé longtemps dans du PFA 4 % à quatre degrés Celsius.

Commencez par remplir un tiers d'un moule d'inclusion avec du milieu d'inclusion poly forze non dilué. Ensuite, placez le lobe pulmonaire dans le moule et continuez à ajouter du milieu jusqu'à ce que le lobe soit entièrement recouvert. Évitez soigneusement la formation de bulles d'air, puis incubez le lobe inclus à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, préparez les poumons inclus pour la sectionnement en les congelant lentement dans un mélange de neige carbonique et d'isopentane. Si nécessaire, ils peuvent maintenant être transférés dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pour le stockage. Sur un cryostat, réalisez des coupes cryogéniques de sept à 10 micromètres des lobes et montez les sections sur des lames prêtes pour cryosections disponibles dans le commerce. Une fois montées, incubez immédiatement les sections dans une solution de coloration Xal à 37 degrés Celsius pendant 24 heures dans une chambre humidifiée. Le lendemain, rincez les lames deux fois dans du PBS, cinq minutes par rinçage.

Suivez par un bref rinçage à l’eau distillée. Contrecolorez ensuite les lames avec le rouge rapide de noyau pendant 10 secondes afin d’obtenir une faible coloration de contraste qui rend le xal plus dominant, puis rincez immédiatement la coloration de contraste à l’eau distillée. Pour une coloration de contraste plus intense, prolongez le temps jusqu’à 30 secondes ou plus.

Montez les lames avec un milieu de montage immuno. La formation de métastases dans les modèles murins OS LM huit a été réexaminée. À l'aide des images représentatives décrites ici, provenant de poumons perfusés et non perfusés de souris ayant reçu simultanément des cellules LM huit transduites laxi et des cellules contrôles non transduites, ainsi que des souris injectées avec des cellules contrôles.

Les métastases macroscopiques et microscopiques sont restées indétectables dans les poumons non perfusés et perfusés. Mais de manière intéressante, chez les souris injectées avec des cellules dun LA Z, la coloration xgl a révélé des foyers micrométastatiques bleus composés de cellules isolées ou de petits agrégats cellulaires à la surface des poumons non perfusés. La perfusion in situ et la fixation des poumons améliorent davantage la détection des micrométastases dun la z. Toutefois, aucune évolution en foyers macroscopiques n’a été observée chez les souris injectées avec les cellules témoins LM huit. Des foyers macrométastatiques translucides, à peine détectables et de diamètre supérieur à 0,1 millimètre, ont été identifiés dans les poumons non perfusés. La perfusion du poumon n’a pas amélioré la détection de ces foyers.

Cependant, chez les souris injectées avec des cellules LAC Z, de nombreuses métastases macroscopiques bleues au X-gal ont été détectées à la surface des organes non perfusés. Des métastases microscopiques ont également été observées à la surface des organes non perfusés. En outre, la perfusion des poumons a encore amélioré la détection des métastases macroscopiques et microscopiques.

Par conséquent, les micro- et macro-métastases sont devenues visibles avec une densité plus élevée et une taille majoritairement plus grande, principalement en raison de la transparence du tissu perfusé, dans lequel des foyers situés sous la surface de l'organe sont également devenus visibles. Une analyse histologique supplémentaire utilisant des sections cryogéniques de tissu pulmonaire a confirmé l'amélioration de la détection des métastases pulmonaires chez les souris injectées avec des cellules LAX Z transduites et des cellules LM huit, ainsi que chez les souris présentant des tumeurs primaires issues de cellules Dun LAX Z. Des micro-métastases ou même des foyers constitués d'une seule cellule ont été identifiés dans les sections pulmonaires.

Ceci n'a pas été observé chez les souris présentant des tumeurs primaires issues des cellules témoins respectives. De plus, les métastases macroscopiques étaient également plus nettement visibles chez les souris injectées avec les cellules LM huit LA C que chez les animaux ayant reçu les cellules LM huit témoins. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer la perfusion et la fixation pulmonaires chez la souris ZI deux, ainsi que du marquage immunohistochimique ultérieur des métastases dans les poumons prélevés.

Cette technique constitue un indicateur très sensible de la distribution des métastases pulmonaires dans toute étude sur le cancer et peut également servir de référence pour l'amélioration des techniques d'imagerie in vivo actuelles, telles que la micro-TDM, la TEP et l'IRM, utilisées pour la détection précoce des lésions métastatiques.