Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic

L'objectif général de cette procédure est de pouvoir mesurer quantitativement la motilité cellulaire au fil du temps à l'aide d'un test de motilité cellulaire basé sur des nanoparticules d'or. Cela est réalisé en préparant tout d'abord des lamelles en verre pour un revêtement de nanoparticules d'or. Plus précisément, des lamelles exemptes d'endotoxines sont recouvertes de gélatine, puis chauffées au four.

La deuxième étape consiste à réduire l'acide chloroaurique, ce qui permet de créer des nanoparticules d'or, puis à recouvrir uniformément les lamelles préalablement revêtues de gélatine avec cette solution. Ensuite, les cellules sont déposées sur les lamelles recouvertes de nanoparticules d'or pendant la durée souhaitée de l'expérience. Puis, la gélatine déplace les nanoparticules d'or, formant ainsi des sillons.

La dernière étape consiste à surveiller et quantifier la motilité cellulaire à l'aide de la microscopie afin d'obtenir des images des trajectoires créées par les cellules en mouvement. En fin de compte, des mesures de surface des trajectoires sont effectuées à l'aide d'un logiciel librement accessible. L'un des principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'imagerie en accéléré, est que ce test ne nécessite qu'un microscope optique standard, une caméra standard, et utilise un logiciel d'imagerie disponible gratuitement.

En outre, ce test permet facilement l'analyse et la comparaison de multiples échantillons à l'aide d'une méthode adaptée au criblage à haut débit. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'influence de différents facteurs physiologiques et sur la mobilité cellulaire, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme l'étude des effets des agents pathogènes sur la motilité des cellules infectées. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car celle-ci exige de suivre strictement les volumes et températures indiqués dans le protocole.

Dans ce protocole, l'accent est mis sur l'évaluation de la couleur de la solution finale contenant les nanoparticules d'or précipitées afin de garantir la réussite. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de l'essai de motilité cinétique sur piste FGO sont difficiles à apprendre.

Ils contiennent plusieurs procédures peu courantes dans les laboratoires de biologie cellulaire et moléculaire. Pour préparer des lamelles recouvertes de gélatine, commencez par resuspendre la gélatine dans de l'eau déionisée afin d'obtenir une solution avec une concentration finale de 0,5 gramme pour 300 millilitres, puis stérilisez le mélange en autoclave pendant 15 à 30 minutes. Il est important d'effectuer cette étape dans les deux heures suivant l'ajout de la gélatine, dans une hotte de culture tissulaire.

Préparez les lamelles pour le revêtement en transférant d'abord huit à neuf lamelles lavées à l'acide dans une boîte en plastique de 100 millimètres. Veillez à ce que les lamelles ne se touchent pas entre elles ni les parois de la boîte. Ajoutez délicatement deux à trois gouttes de gélatine sur chaque lamelle en évitant tout débordement sur la boîte.

Ensuite, placer la boîte contenant les lamelles recouvertes de gélatine dans un four et faire cuire à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après 10 minutes, retirer la boîte du four et la remettre dans la hotte de culture tissulaire.

Aspirez délicatement tout excès de gélatine. Replacez la boîte au four et faites sécher les lamelles à 70 degrés Celsius pendant 45 minutes. Une fois les lamelles sèches, retirez la boîte du four et remettez-la dans la hotte de culture tissulaire.

À l’aide d’une aiguille stérile et délicatement, soulevez un côté de la lame. Ensuite, utilisez des pinces stériles pour retirer les lames recouvertes de gélatine de la boîte et les placer dans des puits séparés d’une plaque de 24 puits. L’étape suivante consiste à préparer des lames recouvertes d’or colloïdal.

Commencez par préparer 10 millilitres d'une solution de citrate de sodium à 0,5 % en travaillant sous une hotte de culture cellulaire. Mélangez 1,5 millilitre de la solution d'acide chloro ORIC à 14,5 millimolaire et 13,5 millilitres d'eau déionisée stérile sans endotoxine dans un flacon Erlenmeyer stérile sans endotoxine. Pour chaque groupe de huit à neuf lamelles, le résultat doit être une solution légèrement jaune. L'acide chloro ORIC est toxique et doit être manipulé avec précaution. Il est également sensible à la lumière, donc l'étape d'ébullition doit être réalisée dans un environnement peu éclairé.

Lorsque la solution a atteint son point d'ébullition, retirez le ballon de la plaque chauffante et transférez-le sur une plaque agitateur. Afin de former les particules d'or colloïdal en solution, ajoutez 0,7 millilitre de la solution de citrate de sodium à 0,5 % par 15 millilitres de la solution d'acide chloroaurique, sous agitation, puis continuez à agiter pendant environ deux minutes. Pendant ce temps, la solution passe d'une couleur jaune pâle à incolore, puis à grise, violette, et enfin à un violet profond.

Avant d’atteindre finalement une couleur rouge vin ou, de préférence, rouille, aspirez la solution d’or colloïdal dans une pipette de 10 millilitres et laissez-la refroidir dans la pipette pendant une à deux minutes, jusqu’à ce qu’elle atteigne la température ambiante. Ensuite, ajoutez 0,5 à 1 millilitre par-dessus les lamelles recouvertes de gélatine dans la plaque à 24 puits. Placez la plaque à 24 puits contenant les lamelles recouvertes d’or colloïdal dans une étuve à 37 degrés Celsius et incubez pendant 30 minutes. Une fois que les particules ont eu le temps de se déposer sur les lamelles recouvertes de gélatine, vérifiez leur densité au microscope optique.

La répartition appropriée des nanoparticules d'or permet de distinguer facilement et efficacement les bords des cellules solaires. La densité optimale varie selon la taille des cellules. Une concentration de particules d'or trop élevée entrave la capacité des cellules à se déplacer, tandis qu'une concentration de particules d'or trop faible limite la possibilité de tracer précisément leur trajectoire de motilité.

Pour cette raison, seules des lamelles provenant du même lot ou calibrées pour avoir la même densité doivent être utilisées ensemble dans des expériences individuelles. Si la concentration de particules d'or est insuffisante, ajouter de 0,5 à un millilitre supplémentaire de solution d'or colloïdal sur les lamelles recouvertes de gélatine. Toutefois, si la concentration de particules d'or est trop élevée, comme dans le cas illustré ici, la seule solution efficace consiste à préparer à nouveau la solution d'or colloïdal et à recouvrir de nouvelles lamelles.

Si la densité des particules est correcte, remettez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et incubez pendant une heure à toute la nuit, puis rincez les particules d’or non liées en plongeant les lamelles trois fois dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile. Ensuite, conservez les lamelles recouvertes d’or colloïdal dans des puits remplis de PBS d’une plaque propre de 12 puits à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées. Les lamelles ne doivent pas sécher et doivent être utilisées dans un délai de deux à trois mois à compter de la date de leur préparation.

L'étape suivante consiste à préparer les lamelles recouvertes d'or colloïdal pour la culture cellulaire. Commencez par les placer dans des puits individuels d'une plaque de 24 puits contenant environ 0,3 millilitre de milieu de culture ajouté préalablement à l'ajout des lamelles. Transférez environ 5 000 à 50 000 cellules sur chaque lamelle recouverte d'or colloïdal. Le nombre de cellules varie selon le type cellulaire, mais la densité cellulaire doit être suffisamment faible pour éviter le chevauchement des trajectoires cellulaires provenant de plusieurs cellules dans une même zone.

Couvrez la plaque et placez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant six à 24 heures. En fonction de la mobilité du type cellulaire, la durée optimale doit être déterminée expérimentalement pour chaque type cellulaire. Après l'incubation, fixez les lamelles qui ne seront pas analysées immédiatement en les trempant deux fois dans du PBS, puis en les incubant dans du paraformaldéhyde à 3 % pendant 15 minutes à température ambiante. Capturez des images des trajectoires créées par une cellule unique en mouvement sur des lamelles non fixées ou fixées. L'agrandissement utilisé pour prendre des photos des trajectoires cellulaires varie selon le type cellulaire. Toutefois, le même agrandissement doit être utilisé pour chaque étude afin de pouvoir comparer les résultats.

Pour les monocytes, un grossissement de 40 x fonctionne bien en utilisant un logiciel librement accessible tel qu’Image, NIH Image ou ImageTool, afin de déterminer la surface moyenne de l’or colloïdal éliminé par 10 à 20 cellules, ou plus, pour chaque échantillon à partir des images capturées. Ici, on observe le trajet dégagé de particules d’or colloïdal par un monocyte unique non stimulé, pris avec un objectif de 40 x. Les cellules non mobiles créent des sillons caractéristiques de petite taille, de forme ovale ou circulaire, autour d’elles-mêmes, ce qui indique un faible niveau de déplacement. En revanche, les cellules très mobiles se caractérisent par un mouvement directionnel, formant des sillons allongés et des surfaces globales plus étendues en raison de leurs formes irrégulières.

Les trajectoires cellulaires sont mieux analysées à l’aide de l’outil de tracé libre dans le logiciel Image J afin de délimiter leur volume. Des mesures quantitatives de surface peuvent ensuite être effectuées à l’aide de l’outil de mesure dans le menu d’analyse d’Image J. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de suivre strictement les volumes et températures indiqués dans le protocole, car des écarts peuvent fortement influencer les résultats finaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de fabriquer des lamelles recouvertes de gélatine, de préparer des nanoparticules d’or et des lamelles recouvertes de nanoparticules d’or, ainsi que de surveiller et d’évaluer quantitativement le mouvement cellulaire à l’aide d’une microscopie optique.

N'oubliez pas que manipuler des solutions bouillantes sur un chauffe-plaque, en particulier les vapeurs provenant de la solution bouillante de fluoro, d'acide AIC et de citrate de sodium, peut présenter des risques ; des précautions telles que travailler sous hotte et faire preuve de bon sens doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.