Un test galvanotaxie pour l'analyse de la cinétique précurseurs neuronaux migration des cellules dans un champ appliqué de l'extérieur électrique à courant continu

L'objectif général de cette procédure est de visualiser la migration de cellules souches neurales adultes en présence d'un champ électrique en courant continu. Cela est réalisé en isolant et en cultivant d'abord des cellules souches neurales subépendymaires provenant de la souris adulte. L'étape suivante consiste à préparer les chambres Galvan Axxis et à transférer les cellules souches neurales sur ces chambres.

La dernière étape consiste à appliquer un champ électrique en courant continu à travers la chambre Galvan Axxis et à réaliser une imagerie en lapse de temps afin d'observer la migration des précurseurs neuronaux. En fin de compte, la microscopie d'imagerie en lapse de temps capture les propriétés galvanotactiques des précurseurs neuronaux dans leurs états différenciés et indifférenciés. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la galvanotaxie des cellules précurseurs neuronaux, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels qu'un modèle de stroke chez la souris pour le recrutement des précurseurs neuronaux vers les sites de lésion afin d'améliorer la réparation neuronale.

La démonstration de la procédure sera effectuée par Rob Pilley, étudiant diplômé de mon laboratoire. Lorsque vous commencez cette procédure, les cellules progénitrices neurales doivent avoir été cultivées pendant sept jours, de sorte que les neurosphères primaires en suspension soient prêtes à être récoltées. Si nécessaire, commencez par préparer trois chambres Galvan Axxis en plaçant trois carrés de verre.

Numéro un, placer les lamelles dans un flacon contenant de l'acide chlorhydrique normal six pendant la nuit. Tôt le lendemain jour, préparer le gel Matra pour qu'il décongèle lentement sur de la glace. Après quatre heures, il sera prêt à être utilisé pour construire la chambre.

Tout d'abord, utilisez un coupe-verre à pointe en diamant pour découper six bandes rectangulaires de verre à partir de nouvelles lames carrées. Numéro un, transférez les lames carrées et les lames rectangulaires lavées à l'acide dans une hotte à flux laminaire.

Lavez les bandes de verre avec de l'éthanol à 70 %, puis avec de l'eau stérile de qualité pour culture de tissus. Laissez-les sécher à l'air ou séchez-les sur du papier sans charpie. Ensuite, appliquez de la graisse à vide sur le pourtour d'une face de chaque lame carrée en verre et scellez-les à la base d'une boîte plastique de 60 millimètres.

Plaques de Pétri. Appliquez de la graisse à vide sur un côté des bandes de verre rectangulaires et scellez-les aux bords opposés du carré. Utilisez des lames de verre pour créer des carrés avec une rigole centrale au centre de chaque plaque.

Stériliser ces carrés ou chambres en verre modifiés par rayonnement UV pendant au moins 15 minutes dans une hotte. Ensuite, pipeter de 250 à 300 microlitres de poly-L-lysine dans la rainure centrale des chambres. Puis incuber les chambres à température ambiante pendant deux heures, environ 15 minutes avant la fin de l'incubation.

Deux heures après, préparez la solution de Matrigel, aspirez la polyolysine et rincez les sillons centraux avec un millilitre d'eau stérilisée au autoclave. Ensuite, pipetez de 250 à 300 microlitres de solution de Matrigel sur les sillons centraux et incubez les chambres à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation, aspirez la solution de Matrigel.

Ensuite, lavez délicatement les sillons centraux avec un à deux millilitres de milieu SFM. Ajoutez maintenant 100 microlitres de E-F-H-S-F-M ou de F-B-S-S-F-M dans les sillons centraux en prévision des cellules cultivées. Ensuite, prélèvez à la pipette quatre à cinq millilitres de la culture contenant les neurosphères et transférez-les dans une nouvelle boîte de Pétri de 60 millimètres.

Ensuite, placez la boîte de Pétri sur la platine du microscope de comptage sous l'objectif d'observation à cinq x. Utilisez une pipette P 10 pour transférer délicatement de cinq à huit neurosphères entières dans la rainure centrale de chaque chambre. Jusqu'à quatre.

Les neurosphères peuvent être transférées immédiatement, mais ne pas les dissocier avec les neurosphères situées dans les sillons centraux. Les répartir soigneusement autour sans perturber le substrat de Matrigel. Ensuite, ajouter 150 microlitres supplémentaires d'E-F-H-S-F-M ou de F-B-S-S-F-M dans les sillons centraux.

À présent, cultivez les cellules dans un incubateur humidifié. Après 17 à 20 heures de culture, les NPCs non différenciés seront disponibles après 69 à 72 heures. En culture, les NPCs différenciés seront disponibles.

Sous le microscope d'observation, sélectionnez la chambre contenant les meilleures cellules pour l'analyse de la migration en imagerie de cellules vivantes. Les cellules doivent être rondes, presque complètement dissociées de leurs neurosphères, et ne pas encore avoir commencé, ou avoir tout juste commencé, à former des prolongements dans une hotte. Préparez un couvercle de chambre.

Lavez une lame carrée en verre avec de l'éthanol à 70 %, puis avec de l'eau stérilisée au autoclave, et appliquez un trait de graisse à vide sur deux bords parallèles. Recouvrez maintenant la chambre. Aspirez d'abord le milieu de culture du sillon central, puis scellez rapidement la lame en la posant sur les parois rectangulaires comme un toit.

Ensuite, à l’aide de l’action capillaire, introduisez 100 microlitres de milieu frais dans la rigole centrale. Utilisez maintenant de la graisse à vide pour créer des limites destinées aux réservoirs de milieu de culture. À chaque extrémité de la rigole centrale du système d’imagerie de cellules vivantes, préparez des tubes en gel d’agarose, des électrodes en argent/chlorure d’argent, ainsi que deux boîtes de Pétri de 60 millimètres à utiliser.

En tant que réservoirs de milieu de culture, laissez les chambres reposer dans un environnement à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 à 30 minutes. Pendant ce temps, préparez les couvercles des deux boîtes de Pétri vides ainsi que le couvercle de la boîte de Pétri contenant les chambres Galvan Axxis en y perçant des trous à l’aide d’un Dremel ou d’une pipette-outil, ajoutez 1,5 à deux millilitres de milieu de chaque côté de la tranchée centrale, puis ajoutez sept à huit millilitres de milieu SFM dans chaque boîte de Pétri vide. Placez une boîte de Pétri de chaque côté de la tranchée centrale de la chambre et insérez une électrode dans chaque boîte.

Combler l’écart entre la chambre et les boîtes de Pétri afin d’établir la continuité électrique. À l’aide des ponts en gel Agros, relier les électrodes à une alimentation externe avec un mètre M en série pour mesurer le courant électrique, puis enclencher l’alimentation. Utiliser un voltmètre pour mesurer directement l’intensité du champ électrique à travers la rigole centrale.

Réglez la sortie de l'alimentation électrique selon les besoins. Lancez maintenant le module d'acquisition en mode laps de temps sur le système d'imagerie. Dans le logiciel Axio Vision, sélectionnez l'acquisition multidimensionnelle et cliquez sur voir.

Pour les canaux, sélectionnez le canal six, cliquez sur T pour la prise de vue en accéléré. Réglez l'intervalle de prise de vue en accéléré à une minute, réglez la durée à huit heures dans les champs de paramètres avant et après le point temporel, sélectionnez le point temporel avant et après. Cliquez maintenant sur démarrer et laissez l'expérience s'exécuter pendant la durée souhaitée ; après la fin du test, poursuivez avec l'analyse HIC.

L'analyse cinématique a révélé que, en présence d'un champ électrique direct (DCEF) de 250 millivolts par millimètre, les cellules progénitrices neuronales non différenciées présentent une migration galvanotactique fortement orientée et rapide vers la cathode à cette intensité de champ ; plus de 98 % des cellules progénitrices non différenciées migraient de manière continue pendant les six à huit heures complètes durant lesquelles elles ont été observées. En l'absence de DCEF, un mouvement aléatoire des cellules a été observé.

Étant donné que les cellules mortes ne migrent pas, cela suggère qu'elles restent viables pendant cette période. En l'absence ou en présence de A-D-C-E-F, les phénotypes différenciés ont présenté une migration négligeable, tant en présence qu'en absence des sous-ensembles de cellules différenciées A-D-C-E-F. Des prolongements étendus ont tendance à s'aligner perpendiculairement à la direction du DCEF, mais aucune translocation notable du corps cellulaire n'a été observée.

Une immunomarquage a confirmé que les cellules souches neuronales conservaient une expression positive du marqueur des précurseurs neuronaux nestin après six heures d'exposition à un champ électrique continu. Dans les essais impliquant des cellules souches neuronales induites à se différencier en phénotypes matures, la majorité des cellules expriment le marqueur des astrocytes matures, la protéine acide fibrillaire gliale ou GFAP, après six heures d'exposition au champ électrique continu. Suite à cette procédure, il est possible d'obtenir des informations sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la transduction du champ électrique continu en motilité cellulaire en utilisant des modèles d'invalidation génétique.

Ou monsieur, un par exemple.