Hétérotypique tridimensionnelle

L'objectif général de l'expérience suivante est de générer des modèles tridimensionnels typiques du développement du cancer de l'ovaire à un stade précoce. Tout d'abord, produire des lignées cellulaires immortalisées H turt issues de tissus primaires d'épithélium ovarien normal et de fibroblastes. Ensuite, afin de recréer l'architecture in vivo et les interactions complexes entre cellules présentes dans l'ovaire, réaliser une co-culture des lignées cellulaires épithéliales et stromales dans des modèles sphéroïdes tridimensionnels, puis fixer et colorer les cultures d'organoides et analyser l'expression de marqueurs spécifiques afin d'étudier les caractéristiques moléculaires des interactions stromales et épithéliales.

Les résultats obtenus montrent comment des altérations dans le compartiment des cellules stromales de modèles 3D typiques peuvent influencer le phénotype des cellules épithéliales cultivées en co-culture. Les modèles tridimensionnels typiques peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer de l'ovaire, telles que l'exploration des origines de cette maladie et l'élucidation du rôle du microenvironnement stromal dans l'initiation et le développement tumoral. Les applications de ces techniques s'étendent vers le diagnostic et le traitement des maladies, par rapport à d'autres méthodes de culture 3D.

Cette technique peut être appliquée à une gamme plus étendue de volumes de culture cellulaire et à diverses applications en aval. Par exemple, les cultures tridimensionnelles homotypiques peuvent être utilisées pour des tests de médicaments in vitro. Cette approche peut également être appliquée à d'autres systèmes modèles, comme dans l'étude d'autres types de tumeurs solides ou des maladies bénignes.

Transportez le tissu ovarien frais au laboratoire de culture cellulaire dans un milieu de croissance pour fibroblastes ovariens normaux immortalisés, supplémenté d'antibiotiques et d'antimycosiques supplémentaires. Lavez l'échantillon trois fois avec cinq millilitres de PBS afin d'éliminer toutes les cellules épithéliales encore faiblement attachées au tissu. Ensuite, transférez l'échantillon avec le PBS dans une boîte de culture P 100 propre. À l'aide d'instruments stériles, transférez le tissu dans une deuxième boîte de culture P 100 sèche et propre.

Coupez le tissu en morceaux de 0,5 centimètre carré et transférez chaque morceau dans une boîte de Pétri P 100 séparée. Continuez à couper le tissu en morceaux de moins d'un millimètre carré de taille. Ajoutez ensuite 20 millilitres de milieu INOF GM et cultivez en surveillant la croissance cellulaire par microscopie de phase.

Vérifiez que les cellules adhèrent à la boîte dans les 24 heures. Surveillez la croissance cellulaire à l’aide d’une microscopie en contraste de phase. Les cellules adhèrent généralement à la boîte dans les 24 heures. Après une semaine, retirez les tissus non adhérents par aspiration, renouvelez le milieu, puis nourrissez les cultures deux fois par semaine pendant une à trois semaines, lorsque les colonies cellulaires atteignent environ 500 microns de diamètre.

Isolez les clones à l'aide de triplicats et de disques de clonage revêtus. Afin de confirmer la présence de cellules fibroblastiques à 100 %, ensemencez un échantillon de la lignée cellulaire sur des lamelles en verre et réalisez une coloration immunofluorescente pour un marqueur fibroblastique, un marqueur épithélial et un marqueur de cellule endothéliale.

Un jour avant la transduction rétrovirale du passage H Turt, isoler les fibroblastes ovariens normaux d'une seule boîte P 100 en trois boîtes P 100. Le surnageant viral préparé peut être acheté ou produit en interne selon des protocoles standard de transfection simultanée de cellules HEC 2 9 3 T. Pour préparer la solution de poly-héma, peser 1,5 gramme de poly-héma et placer dans un flacon stérile.

Ajouter 95 millilitres d'éthanol absolu de qualité pour biologie moléculaire et 5 millilitres d'eau distillée de qualité pour culture cellulaire. Placer la solution de poly-HEMA dans un bain-marie à 65 degrés Celsius jusqu'à dissolution complète. Recouvrir les boîtes de culture cellulaire avec une solution fraîchement préparée de poly-HEMA.

Laisser sécher à l'air les boîtes de culture cellulaire à l'intérieur de la hotte à flux laminaire. Un mouvement doux de basculement sur une plateforme agitatrice peut être utilisé pour assurer un revêtement uniforme des boîtes ou des flacons de grande taille. Si la solution de polyus sèche trop rapidement, la surface ne sera pas lisse.

Si désiré, prétraitez les fibroblastes avant la culture en 3D ; par exemple, pour induire la sénescence, traitez les cellules avec des doses sub-létales de peroxyde d'hydrogène. Récupérez et amplifiez les cultures de cellules INOF et épithéliales in vitro afin d'obtenir suffisamment de cellules pour établir des stéroïdes hétérotopiques en 3D. Après un lavage au PBS de cinq minutes, ajoutez 15 millilitres de milieu dans la plaque en poly-héma.

Entre-temps, ajoutez de la trypsine aux cellules de fibroblastes ovariens normaux immortalisés afin de les détacher de la boîte de culture. Après trois à cinq minutes, neutralisez la trypsine avec un volume équivalent de milieu de culture et récoltez les cellules par centrifugation. Resuspendez le culot cellulaire dans cinq millilitres de milieu et mélangez soigneusement en pipetant plusieurs fois ou en vortexant doucement.

Ensuite, utilisez un échantillon de 10 microlitres pour dénombrer les cellules viables à l’aide de bleu de trypan. Ajoutez maintenant 4 millions de cellules INOF au milieu déjà distribué dans la plaque revêtue de poly-héma. Complétez le volume du milieu de culture jusqu’à 20 millilitres et incubez à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone.

Surveiller l'agrégation cellulaire en stéroïde multicellulaire par microscopie de phase afin de nourrir à nouveau les cultures de sphéroïdes S tous les deux à trois jours. Incliner les plaques sur une pipette. Laisser les sphéroïdes se déposer, puis retirer soigneusement environ 16 millilitres du milieu épuisé à l’aide d’une pipette de cinq millilitres.

Ajoutez 16 millilitres de milieu frais à la culture et remettez-la dans l'incubateur le jour sept. Créez des cultures hétérotypiques en ajoutant des cellules épithéliales aux fibroblastes phe. Préparez d'abord des suspensions de cellules épithéliales ovariennes par trypsine, comme décrit précédemment, après avoir dénombré les cellules.

Laver une fois dans le milieu GM INOF afin d'éviter tout transfert de facteurs de croissance provenant du milieu de croissance épithélial. Après renouvellement du milieu des cultures d'OID fibroblastes, ajouter les cellules épithéliales selon un ratio de quatre fibroblastes pour une cellule épithéliale. Les OID hétérotopiques dans le milieu GM INOF nécessitent un renouvellement du milieu tous les deux à trois jours pendant encore 14 jours.

Pour l'immunohistochimie, fixer le PHE avec du formol tamponné neutre, centrifuger le PHE et remplacer le formol par de l'éthanol à 70 %. Procéder au traitement dans la paraffine en utilisant des protocoles standards employés pour les tissus humains. Les stéroïdes inclus dans la paraffine peuvent être coupés en sections et colorés en H-E ou avec des marqueurs moléculaires spécifiques par immunohistochimie.

Alternativement, lavez les stéroïdes dans du PBS et fixez-les dans du paraformaldéhyde à 4 %. Ensuite, incluez les échantillons dans un milieu OCT et congélez-les rapidement pour la coupe au cryostat et la coloration immunofluorescente, suivies d'une analyse par cytométrie en flux. Lavez les stéroïdes dans du PBS et dissociez-les par digestion à la trypsine ou à l'Accutase à 37 degrés Celsius.

La dissociation complète des stéroïdes en une suspension de cellules uniques peut être favorisée en aspirant et expulsant la solution plusieurs fois à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Veillez à ne pas endommager les cellules. Neutralisez la réaction avec un volume égal de milieu de culture et éliminez les agrégats cellulaires en faisant passer la suspension à travers un tamis cellulaire de 40 à 70 microns. Ensuite, centrifugez les cellules pour former un culot, lavez-les avec du PBS, comptez-les, resuspendez le nombre désiré de cellules dans un tampon facts et réalisez la coloration selon les instructions du fabricant. Dans notre laboratoire, nous avons partiellement transformé des cellules épithéliales ovariennes et nous avons mis en co-culture ces cellules avec des fibroblastes ovariens normaux et sénescentes afin de modéliser le développement d’un cancer de l’ovaire au stade précoce.

Dans un ovaire pré-ménopausé, la coloration immunofluorescente de fibroblastes ovariens normaux immortalisés h hert montre que les fibroblastes ovariens normaux primaires ainsi que les fibroblastes ovariens normaux immortalisés expriment la protéine spécifique des fibroblastes, mais n'expriment pas la cytokeratine 7 et expriment menton. Les cellules de fibroblastes ovariens normaux cultivées seules en 3D dans un gel de PHE présentent une morphologie fusiforme et une matrice extracellulaire abondante. Ici, les fibroblastes ovariens normaux ont été exposés au peroxyde d'hydrogène afin d'induire un état de sénescence pendant sept jours, puis cultivés avec des cellules épithéliales ovariennes partiellement transformées pendant 14 jours.

Pour distinguer les deux types cellulaires, les stéroïdes obtenus ont été marqués par immunohistochimie pour mim-1, utilisé comme marqueur de prolifération, et pour la pan-cytokératine, utilisée comme marqueur épithélial. La quantification des données suggère que le microenvironnement âgé favorise les caractéristiques néoplasiques de cellules épithéliales partiellement transformées, tandis qu'un microenvironnement normal inhibe la progression néoplasique. Des caractéristiques histologiques des cellules normales et malignes, non détectables lorsque les cellules sont cultivées en monocouche, sont restaurées. Lorsque les cellules sont transférées en culture sphéroïde, par exemple, les caractéristiques histologiques des cancers ovariens à cellules claires peuvent être détectées dans des cultures tridimensionnelles de lignées cellulaires de cancer ovariens à cellules claires, mais pas dans des cultures en monocouche des mêmes cellules.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place des cultures tridimensionnelles typiques permettant d'étudier les interactions entre les cellules épithéliales et les cellules stromales au cours des premières étapes de la genèse tumorale. Lors de la mise en place d'une culture en 3D, il est important d'ajuster le nombre de cellules en fonction de l'application en aval, en tenant compte d'une éventuelle perte de matériel pendant le traitement.

Une fois maîtrisées, les cultures en 3D peuvent être mises en place en une heure en suivant cette procédure. D'autres méthodes, telles que la cytométrie en flux combinée à l'analyse d'expression génique par microréseaux, peuvent être réalisées afin d'analyser les modifications globales de l'expression génique qui surviennent dans les cultures typiques en 3D mais qui ne sont pas détectées dans des conditions de culture en monocouche. Cela permettra d'élucider les voies de signalisation bidirectionnelles qui se produisent spécifiquement dans un microenvironnement de culture en 3D.