Haut débit séquentiel ELISA pour la validation des biomarqueurs de réaction aiguë du greffon contre l'hôte

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser un Eliza séquentiel à haut débit afin d'analyser efficacement un grand nombre de nouveaux biomarqueurs découverts par protéomique. Cela est réalisé en ajoutant d'abord des échantillons à une plaque source, utilisée pour créer une dilution de chaque biomarqueur et pour stocker le plasma récupéré entre les tests. Ensuite, des Eliza sont réalisés pour chaque protéine afin de déterminer leurs concentrations dans les échantillons de patients.

En fin de compte, l'augmentation des concentrations protéiques de ces biomarqueurs au moment de l'apparition des manifestations cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte aiguë peut être évaluée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait que les analyseurs séquentiels peuvent analyser plusieurs protéines nouvelles qui ne sont pas toujours accessibles avec les plates-formes de multiplexage élevé. Les implications de cette technique s'étendent à l'égard du diagnostic de la maladie du greffon contre l'hôte aiguë.

Des biomarqueurs validés par cette méthode sont actuellement à l'étude pour les soins cliniques. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les complications après une transplantation de cellules souches post-traumatique, elle peut également être appliquée à la découverte et à la validation de biomarqueurs pour d'autres maladies, telles que la transplantation pulmonaire, les complications, le cancer du poumon, ou potentiellement toute maladie pour laquelle un test sanguin diagnostique s'avérerait utile.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il est important que les multiples étapes soient réalisées de manière constante afin d'assurer la reproductibilité et une faible variabilité entre les lots. La veille de l'expérience, centrifuger les échantillons d'aliquote de plasma pendant 10 minutes à 15 300 RCF et à quatre degrés Celsius afin de séparer les caillots situés au fond des lipides présents en surface. Ensuite, déposer 150 microlitres de plasma non dilué de chaque échantillon dans une plaque V en fond de 96 puits à l’aide d’une pipette manuelle, conformément aux schémas prédéfinis. Envelopper la plaque dans du Paraform et la placer dans une chambre humide à quatre degrés Celsius pendant un maximum de 72 heures.

Ensuite, après la reconstitution et la dilution des anticorps de capture du récepteur alpha de l'IL-2 et du facteur de croissance humain, ou HGF, conformément aux spécifications du fabricant, placer des aliquots de 50 microlitres de chaque anticorps dans chaque puits de plaques 96 puits à demi-puits à liaison élevée. Puis sceller ces plaques avec un scellant pour plaque et les incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Diluer maintenant le reg trois alpha avec le tampon d'immobilisation du fabricant selon le protocole du fabricant et placer 25 microlitres de la solution dans chaque puits d'une plaque 3 84 puits sans maxor.

Ensuite, conserver ce plateau scellé à quatre degrés Celsius également le premier jour de l'expérience. Commencer par laver le plateau de test du récepteur IL-2 alpha et le bloquer avec du blotto dans du TBS. Après la reconstitution du standard, préparer une courbe standard à huit points conformément au protocole du fabricant.

Transférez ensuite 50 microlitres de plasma non dilué et 50 microlitres de chaque étalon en double depuis la plaque source vers la plaque de test ELISA. Incubez ensuite la plaque scellée à température ambiante sur un agitateur rotatif réglé à 300 tr/min. Après deux heures, récupérez le plasma de la plaque de test ELISA du récepteur IL-2 alpha et replacez-le dans la plaque source de plasma non dilué.

Ensuite, après avoir effectué le test immunoenzymatique (EIA) conformément au protocole du fabricant, mesurer la densité optique de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur une longueur d’onde de 450 à 570 nanomètres pour le test Eliza rich three alpha. Transférer d’abord 10 microlitres de plasma non dilué vers une plaque source séparée à fond transparent, puis ajouter 90 microlitres du tampon de dilution fourni par le fabricant à chaque puits afin de créer une plaque source diluée au 1/10. Après avoir complété le test Reg three alpha Eliza conformément au protocole du fabricant, ajouter la solution d’arrêt à la plaque 384 puits et mesurer la densité optique de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur une longueur d’onde de 450 à 620 nanomètres. Après reconstitution et dilution des anticorps de capture elephant et tn FFR un selon les spécifications du fabricant, distribuer dans chaque puits des respectives plaques demi-puits à liaison élevée 96 puits 50 microlitres des anticorps de capture.

Ensuite, incuber les plaques d'essai scellées toute la nuit à température ambiante pour la plaque éléphant et à quatre degrés Celsius pour la plaque TN FFR. Après avoir terminé le transfert du récepteur IL deux alpha Eliza, transférer 60 microlitres de plasma non dilué vers une nouvelle plaque source. Puis ajouter 60 microlitres de BSA à 1 % dans du PBS à chaque puits afin d'obtenir une plaque source de plasma diluée au 1/2.

Ensuite, lavez et bloquez la plaque de test HGF avec du BLOTTO dans du TBS, puis préparez la dilution à huit points de la courbe standard. Après lavage de la plaque, suite à l'étape de blocage, ajoutez 50 microlitres d'aliqotes dupliqués de plasma dilué un à deux fois et de chaque standard sur la plaque de test EISA. Incubez ensuite la plaque scellée toute la nuit à température ambiante sur un agitateur rotatif réglé à 300 tr/min.

Le lendemain matin, récupérez le plasma dilué au ratio d’un à deux à partir de la plaque du test Eliza HGF et replacez-le dans la plaque source de plasma dilué au ratio d’un à deux. Après avoir terminé le dosage immuno-enzymatique (EIA) conformément au protocole du fabricant, mesurez la densité optique de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur 450 à 570 nanomètres, le deuxième jour de l’expérience. Transférez d’abord 10 microlitres de plasma non dilué vers une nouvelle plaque source, puis ajoutez 190 microlitres de BSA à 1 % dans du PBS afin d’obtenir 200 microlitres de plasma dilué au ratio d’un à vingt.

Ensuite, après avoir terminé l'éléphant, Eliza a mesuré la densité optique à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur 450 à 570 nanomètres, conformément au protocole du fabricant. Pour le TN FFR un, Eliza a d’abord ajouté 25 microlitres de BSA à 1 % dans du PBS dans la plaque source diluée au un sur vingt, ce qui donne 125 microlitres de plasma dilué au un sur vingt-cinq par puits. Ensuite, après avoir réalisé le TN FFR un EIA selon le protocole du fabricant, mesurer la densité optique de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur 450 à 570 nanomètres ; pour le I-L-H-E-I-A, transférer d’abord 60 microlitres de plasma dilué au un sur deux vers une nouvelle plaque source, puis ajouter 180 microlitres de diluant IL huit à chaque puits afin d’obtenir une plaque source de plasma diluée au un sur six.

Ensuite, après avoir effectué le test ELISA ELIZA conformément au protocole du fabricant, lire la densité optique de chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur 450 à 570 nanomètres. Enfin, une fois tous les tests ELIZA terminés, replacer le plasma inutilisé dans l’Eloqua et congeler pour une utilisation ultérieure. Sur ce graphique, les densités optiques de la courbe standard de sept plaques ELIZA différentes mesurant les concentrations de reg trois alpha correspondant aux 1084 patients testés dans le cadre du rapport initial sur le biomarqueur de la maladie du greffon contre l’hôte gastro-intestinal reg trois alpha sont présentées ; des densités optiques cohérentes entre les plaques garantissent des mesures de concentration en protéines reproductibles entre les expériences.

Les concentrations des protéines dans les échantillons de plasma ont été calculées en comparant les densités optiques des échantillons aux densités optiques de la courbe standard. Une plateforme automatisée de manipulation propre peut être utilisée pour améliorer davantage la reproductibilité tout en réduisant le volume de plasma nécessaire, en utilisant des plaques de microtitration ELISA et des plaques à puits spécifiques. Lors de la planification de cette procédure, il est important d'effectuer d'abord les tests EIS avec du plasma non dilué afin qu'il puisse être récupéré et utilisé dans des expériences ultérieures après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique pour explorer des biomarqueurs candidats dans toute maladie d'intérêt grâce à l'utilisation universelle des Eliza séquentielles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de valider plusieurs biomarqueurs à l'aide d'Eliza séquentielles tout en utilisant de petits volumes de plasma et en minimisant les cycles libres.