L'utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

L'objectif de la procédure suivante est de démontrer comment préserver les lysosomes de deux types d'échantillons, des embryons de souris et des cellules souches différenciées, à l'aide d'un colorant lyo tracker afin de détecter les profils de mort cellulaire. Pour préparer les échantillons embryonnaires, les embryons sont d'abord isolés chirurgicalement puis placés dans une boîte pour préparer les cellules différenciées. Les cellules souches embryonnaires sont utilisées pour former des corps embryonnaires.

Les embryons sont cultivés en suspension, puis développés en monocouche sur une lamelle à chambre. La monocouche d'embryons peut être incubée avec le colorant Ot Tracker Red, puis les échantillons sont rincés et fixés avant d'être photographiés afin d'examiner et de quantifier les résultats de coloration obtenus avec Liso Tracker. La coloration constitue une procédure simple pouvant être utilisée pour évaluer la mort cellulaire programmée dans les embryons et les cellules en culture.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'analyse du tunnel, réside dans le fait que le colorant traceur OT étant une petite molécule, les tissus épais peuvent être analysés rapidement et facilement. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur les schémas de mort cellulaire programmée chez les embryons de souris et les cultures différenciées, elle peut également être appliquée à d'autres types de tissus, tels que les embryons de poulet et les cellules souches adultes en cours de différenciation. Accouplez des souris femelles jeunes avec un mâle reproducteur et, les matins suivants, vérifiez la présence d'un bouchon vaginal, signe que l'accouplement a eu lieu.

Le milieu de journée du jour où apparaît la plaque vaginale correspond effectivement à 0,5 jour. Après le coït, au jour embryonnaire d'intérêt, euthanasier la femelle selon les protocoles approuvés et retirer l'utérus dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du BSS de Hank, puis rincer tout sang. Séparer les embryons et les extraire de l'utérus.

Retirez les membranes extra-embryonnaires et effectuez au moins un rinçage avec la solution BSS de Hank pour éliminer les tissus et le sang résiduels. Conservez les embryons disséqués sur de la glace pendant le nettoyage. Les autres.

Préparez cinq millilitres de solution de coloration embryonnaire Liso tracker. Ce volume est suffisant pour un ou deux prélèvements d'embryons. Mélangez doucement la solution pour disperser le colorant, puis transférez délicatement les embryons dans la solution et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes.

Après l'incubation, rincer délicatement les embryons dans la BSS de Hank quatre fois, cinq minutes par rinçage. Il est important d'effectuer les rinçages avec douceur afin de ne pas endommager le tissu. Éliminer le liquide lentement en portant une attention particulière à l'emplacement des embryons fragiles, et veiller à toujours laisser une partie du liquide recouvrant ceux-ci.

Ensuite, fixer les embryons dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant toute la nuit le jour suivant. Rincer les embryons une fois dans la solution saline de Hank (BSS) pendant 10 minutes afin d'éliminer le fixateur. Procéder maintenant à la déshydratation des tissus par une série de méthanol pour éliminer la coloration de fond.

Cette étape améliore le rapport signal sur bruit lors de l'acquisition d'images avant le stockage. Si nécessaire, prélève un échantillon de tissu sur chaque embryon pour une analyse génétique. Par la suite, réhydrate l'échantillon de tissu avant le génotypage.

Séparez les embryons dans des tubes individuels avec des étiquettes correspondant à l'échantillon de tissu. Il est désormais possible de conserver indéfiniment les embryons isolés dans du méthanol à moins 20 degrés Celsius, à l’abri de la lumière.

Commencez par préparer des corps embryonnaires selon la méthode de la goutte pendante. Avec une densité initiale de 500 cellules par goutte de 20 microlitres, transférez les corps embryonnaires en cultures en suspension dans des boîtes de Pétri non adhérentes de 10 centimètres après trois jours. Incubez-les pendant cinq jours, en changeant le milieu tous les deux jours à partir du cinquième jour.

Transférez les embryons dans des lamelles à huit chambres gélatinées, en plaçant un ou deux embryons dans chaque chambre. Incubez les embryons pendant encore 10 jours. Tous les deux jours après ces 10 jours, changez le milieu : aspirez délicatement le milieu existant et ajoutez 300 microlitres de solution de marquage cellulaire Lyo tracker dans chaque chambre.

Veillez à pipeter manuellement le milieu en plaçant la pointe de la pipette dans le coin de la chambre. Ainsi, vous n'enlèverez pas accidentellement les cellules, qui sont encore en cours d'attachement, de la surface en verre. Lorsque vous rajoutez le milieu, placez la pointe de la pipette dans le coin de la chambre et ajoutez lentement le milieu.

Incuber les chambres à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Puis les rincer deux fois avec du DPBS pendant cinq minutes par rinçage. Fixer ensuite les cellules dans du paraformaldéhyde 4 % pendant 15 minutes à température ambiante.

Ensuite, éliminer le fixateur avec du DPBS lors de deux rinçages de cinq minutes. Pour monter les embryons, les placer dans une lame en verre à cavité profonde ou dans un petit plat de Petri avec un bouclier infectieux. Préparer les échantillons cellulaires pour la microscopie en aspirant le DPBS.

Retirez la chambre de la lame et laissez-la sécher à l'air pendant environ cinq minutes. Couvrez-la de papier d'aluminium pour protéger le fluorochrome. Ensuite, ajoutez un milieu de montage aqueux tel que Vector Shield avec DAPI et placez une lamelle par-dessus.

La lame est désormais montée et prête à être observée. Visualisez les échantillons à l’aide d’un microscope stéréoscopique ou composé équipé d’un filtre pour la rhodamine, le DAPI ou le Texas red. La coloration est généralement très intense, des temps de pose longs ne sont donc généralement pas nécessaires en mode manuel.

Prenez des photos numériques de tous les échantillons dans les mêmes conditions d'exposition. Pour quantifier les images, ouvrez-les dans Adobe Photoshop ou un logiciel d'imagerie similaire. Pour déterminer la quantité de coloration par le traceur lyo, sélectionnez le canal rouge.

Notez le nombre de pixels pour l'image entière tel qu'indiqué par la fonction d'histogramme. Ensuite, seuillez l'image de manière à ce que la coloration rouge soit désormais représentée par des pixels blancs. Cela convertit l'image en noir et blanc.

Choisissez un seuil et utilisez ce seuil pour toutes les images du jeu. Sélectionnez les pixels blancs à l'aide de l'outil de plage de couleurs et utilisez la fonction d'histogramme pour obtenir le nombre total de pixels blancs. Utilisez le canal bleu pour compter le nombre de noyaux dans le champ.

Il peut être utile de conserver une trace du décompte en annotant l'image, d'enregistrer les valeurs et de les utiliser pour calculer le niveau moyen de marquage par cellule. Répétez cette analyse avec le même seuil pour toutes les images restantes. Pour l'échantillonnage, un traceur ly o a été utilisé pour colorer les embryons mutants du hérisson sonique.

Étant donné que le traceur ly O est une petite molécule hautement diffusible, des régions profondes à l'intérieur du mésenchyme d'un embryon entier coloré à 10,5 jours post-coïtum ont révélé une mort cellulaire programmée, ou PCG, fortement accrue dans les embryons mutants nuls pour sonic hedgehog, en particulier dans les bourgeons des membres et certaines régions cérébrales. Les bourgeons des membres ont été observés en monture complète à un grossissement plus élevé afin d'évaluer le motif général. Des portions disséquées ont également été sectionnées à l'aide d'un microtome vibrant.

La flèche indique une coloration accrue au niveau de l'extrémité distale dépourvue de sonic hedgehog, observée sur des coupes obtenues à l'aide d'un cryostat. Une coloration TUNEL a été utilisée conjointement avec OT Tracker sur ces sections. Bien qu'il n'existe pas de corrélation stricte un-à-un entre le traceur lyo et la coloration TUNEL, les régions générales de mort cellulaire programmée (PCD) se superposent considérablement en forte augmentation. On peut observer des cellules présentant une coloration positive au test TUNEL mais pas au colorant otra, d'autres colorées uniquement avec le colorant lyra, ainsi que des cellules présentant une coloration superposée. Après 10 jours de culture de l'embryon en milieu contrôlé, les cellules se sont différenciées en divers types cellulaires, notamment des neurones, des cellules musculaires et des cardiomyocytes.

Dans la culture normale de cellules ES différenciées, quelques cellules ont subi une mort cellulaire programmée (PCD), comme détecté par les tests au lyo tracker et au tunnel. Ensuite, les cellules ont été traitées avec du peroxyde d'hydrogène afin d'induire une mort cellulaire par stress oxydatif. Une faible dose de peroxyde d'hydrogène a augmenté la coloration au lyo tracker et au tunnel par rapport à l'absence de traitement.

Comme dans les résultats obtenus avec l'embryon, les deux colorations ont marqué des cellules communes et uniques. Une forte dose de peroxyde d'hydrogène a entraîné un rétrécissement cellulaire ainsi qu'une positivité plus étendue au traceur OT et au test TUNEL. À titre de comparaison, une privation de sérum a été utilisée pour induire l'autophagie après une heure de privation de sérum.

La coloration du traceur OT a augmenté. Cependant, la positivité au test TUNEL est restée à des niveaux normaux. Ainsi, bien que le reer soit simple et utile, il est important de réaliser des tests complémentaires pour déterminer si la coloration reflète une apoptose ou une autophagie après la quantification des échantillons.

À l'aide de la méthode simple de Photoshop démontrée précédemment, les résultats ont confirmé que des concentrations croissantes de peroxyde d'hydrogène entraînaient un niveau plus élevé de coloration par le lys tracker. Une fois maîtrisée, cette procédure de coloration peut être réalisée en moins de deux heures si elle est effectuée correctement en suivant ce protocole. D'autres méthodes, comme la coloration immuno-histochimique avec NX in five ou lc three, peuvent être réalisées afin de confirmer le type de mort cellulaire. N'oubliez pas que le Trecker vert ne fonctionne actuellement que sur des cellules vivantes ; par conséquent, le Reca rouge est votre meilleure option pour les échantillons nécessitant une fixation.